Dr. K. Luden Zapewnianie jakości pracy laboratorium przez badania międzylaboratoryjne Badanie biegłości Dr Katrin Luden Warschau Nov. 2008 1

Dyrektywa w sprawie wody do spożycia 98/83/WE Dr. K. Luden Dyrektywa w sprawie wody do spożycia 98/83/WE Załącznik III Specyfikacja dla analizy parametrów Każde Państwo Członkowskie musi zapewnić, że każde laboratorium, w którym analizowane są próbki, posiada system kontroli jakości analiz, podlegający okresowemu sprawdzaniu przez osobę niepodlegającą danemu laboratorium i zatwierdzoną przez odpowiednie władze do tego celu. Warschau Nov. 2008 2

Niemiecka ustawa o wodzie do spożycia Dr. K. Luden Niemiecka ustawa o wodzie do spożycia § 15 Metody analityczne i laboratoria (4) Wymagane analizy, w tym pobieranie prób, przeprowadzane będą przez laboratoria pracujące zgodnie z „powszechnie akceptowanymi zasadami techniki” (allgemein anerkannte Regeln der Technik), posiadające wewnętrzny system kontroli jakości, uczestniczące przynajmniej raz do roku w zewnętrznych programach zapewniania jakości, dysponujące personelem o odpowiednich kwalifikacjach i akredytowane przez powszechnie uznaną jednostkę akredytacyjną. Odpowiedzialny najwyższy organ federalny opublikuje listę laboratoriów jemu podległych. (5) Władze (federalne) niezależne od laboratoriów sprawdzać będą regularnie, czy warunki określone w punkcie (4) zostały spełnione. Warschau Nov. 2008 3

Dr. K. Luden Badanie biegłości Uczestnictwo w programach badania biegłości pozwala laboratoriom: Identyfikować obszary, w których potrzebna jest poprawa wykonywania badań i pomiarów Identyfikować potrzeby szkoleniowe personelu Potwierdzić ufność w przeprowadzane badania i pomiary Potwierdzić zdolność laboratorium do przeprowadzania akredytowanych badań i kalibracji Warschau Nov. 2008 4

Dżungla standardów dot. BB / ZZJ Dr. K. Luden Dżungla standardów dot. BB / ZZJ Istnieje kilka standardów i wytycznych opisujących programy BB / EQA (w kolejności chronologicznej • Przewodnik ISO/IEC 43-1:1996 Badanie biegłości w formie międzylaboratoryjnych badań porównawczych – Część 1: Opracowywanie i obsługa programów badania biegłości • ISO 13528:2005 Metody statystyczne wykorzystywane w badaniu biegłości w formie międzylaboratoryjnych badaniach porównawczych • Raport techniczny IUPAC 1/2006 Międzynarodowy zharmonizowany protokół badania biegłości chemicznych laboratoriów analitycznych • ILAC-G13:2007 Wytyczne ILAC w sprawie kompetencji dostawców programów badania biegłości • ISO/TS 20612 Jakość wody – międzylaboratoryjne badania porównawcze do badania biegłości chemicznych laboratoriów analitycznych • ISO/IEC CD 17043:2008 Ocena zgodności – ogólne wymogi badań biegłości Warschau Nov. 2008 5

Zapewnianie Jakości przez jednostki zewnętrzne (ZZJ) Dr. K. Luden Zapewnianie Jakości przez jednostki zewnętrzne (ZZJ) Rekomendacja Federalnej Agencji Środowiska 2002 - Mikrobiologia Warschau Nov. 2008 6

Zapewnianie Jakości przez jednostki zewnętrzne (ZZJ) Dr. K. Luden Zapewnianie Jakości przez jednostki zewnętrzne (ZZJ) Rekomendacja Federalnej Agencji Środowiska 2002 - Mikrobiologia Parametr zakończony pozytywnym wynikiem udział w programach badania biegłości E. coli/Coliformy Enterococci Liczebność kolonii 2x / rok Clostridium perfringens Legionella Pseudomonas aeruginosa 1x / rok Wirusy enteropatogenne Cryptosporidium parvum Międzynarodowe BB Warschau Nov. 2008 7

Zapewnianie Jakości przez jednostki zewnętrzne (ZZJ) Dr. K. Luden Zapewnianie Jakości przez jednostki zewnętrzne (ZZJ) Rekomendacja Federalnej Agencji Środowiska 2003 - Chemia Parametr zakończony pozytywnym wynikiem udział w programach badania biegłości Wszystkie parametry badane przez laboratorium 1x na 2-3 lata Badanie biegłości (BB) według DIN 38402-45 Warschau Nov. 2008 8

Jednostki organizujące badania biegłości w Niemczech Dr. K. Luden Jednostki organizujące badania biegłości w Niemczech Mikrobiologia i chemia w ochronie zdrowia Chemia Regularne spotkania, zharmonizowane terminy, identyczna ocena statystyczna → porównywalność dla laboratoriów i władz Warschau Nov. 2008 9

DIN 38402-45 Norma może być zastosowana, jeżeli: Dr. K. Luden DIN 38402-45 Norma może być zastosowana, jeżeli: Analizowany parametr może zostać uznany za mierzalny w trybie ciągłym prawda w przypadku większości parametrów chemicznych i fizyko-chemicznych nie zawsze prawda w przypadku parametrów biologicznych i/lub mikrobiologicznych Zastosowanie w chemii: tak Zastosowanie w mikrobiologii: w drodze prób / w większości przypadków Warschau Nov. 2008 10

Dr. K. Luden BB mikrobiologia Państwowy Instytut Zdrowia Publicznego Dolnej Saksonii (NLGA) świadczy usługi w zakresie badań biegłości (BB) w dziedzinie pomiarów mikrobiologicznych w wodzie do spożycia w Niemczech Co roku: 4 BB w obszarze E. coli / coliformy, Enterococci i liczebność kolonii 2 BB w obszarze Pseudomonas aeruginosa, Clostridium perfringens i Legionella 1 BB w obszarze stanu wody w kąpieliskach wg przepisów UE (E. coli, coliformy) 1 BB w obszarze wybranych parametrów „higieniczno – chemicznych” Warschau Nov. 2008 11

BB mikrobiologia Parametr Metody 1986 -1999 2000 2001 2002 2003 2004 Dr. K. Luden BB mikrobiologia Parametr Metody 1986 -1999 2000 2001 2002 2003 2004 2006 2007 2008 E. coli – coliformy Test na obecność DIN EN ISO 9308-1 Colilert®-18/Quanti-Tray® + (+) Liczebność kolonii Niemiecka ustawa DWD 1990 DIN EN ISO 6222 Enterococci EN ISO 7899-2 Chromocult®-Enterococci-Agar Clostridium perfringens DWD (mCP-Agar) TSC Pseudomonas aeruginosa EN 12780/ISO 16266 Legionella spec. GVPC (ISO 11731-2) Dyrektywa UE ws. wody w kąpieliskach Coliformy fekalne DIN EN ISO 9803-3 Enterococci jelitowe DIN EN ISO 7899-2 DIN EN ISO 7899-1 Warschau Nov. 2008 12

BB mikrobiologia Parametr Metody 1986 -1999 2000 2001 2002 2003 2004 Dr. K. Luden BB mikrobiologia Parametr Metody 1986 -1999 2000 2001 2002 2003 2004 2006 2007 2008 E. coli - coliformy Test na obecność DIN EN ISO 9308-1 Colilert®-18/Quanti-Tray® + (+) Liczebność kolonii Niemiecka ustawa DWD 1990 DIN EN ISO 6222 Enterococci EN ISO 7899-2 Chromocult®-Enterococci-Agar Clostridium perfringens DWD (mCP-Agar) TSC Pseudomonas aeruginosa EN 12780/ISO 16266 Legionella spec. GVPC (ISO 11731-2) Dyrektywa UE ws. wody w kąpieliskach Coliformy fekalne DIN EN ISO 9803-3 Enterococci jelitowe DIN EN ISO 7899-2 DIN EN ISO 7899-1 Warschau Nov. 2008 13

Materiał liofilizowany Dr. K. Luden Próby do BB – dwie opcje Próby płynne Materiał liofilizowany Roztwór bakterii na określonym podłożu mineralnym Bakterie adsorbowane na mleku w proszku Próby bardzo realistyczne Postępowanie dokładnie takie, jak w przypadku prawdziwej próby Należy przygotować roztwór i pierwszy krok postępowania jest inny, niż w przypadku prawdziwej próby Stabilność 4 – 6 dni od wysyłki w <10°C Stabilność w temp. -20°C przez kilka tygodni lub miesięcy Niemcy Wielka Brytania, Francja, Szwecja, Australia... Warschau Nov. 2008 14

Dr. K. Luden Przygotowanie w NLGA Warschau Nov. 2008 15

Wysyłka 300 - 500 uczestników BB Zarejestrowano: Dr. K. Luden Wysyłka 300 - 500 uczestników BB Zarejestrowano: > 700 Laboratoriów z Niemiec Austrii (26) Szwajcarii (8) Litwy (2) Węgier(2) Wielkiej Bryt. (1) Luksemburga (1) Warschau Nov. 2008 16

Terminarz programu badań biegłości Dr. K. Luden Terminarz programu badań biegłości Rejestracja uczestników Potwierdzenie rejestracji (4 tygodnie przed BB) Przygotowanie i wysyłka prób Wewnętrzna kontrola jakości (dwa tygodnie przed i 6 dni po wysyłce) Raport nt. wyników (w ciągu 16 dni od wysyłki) Ocena wyników zazwyczaj w ciągu 4 tygodni po terminie składania raportów Warschau Nov. 2008 17

Co dostają laboratoria? Dr. K. Luden Co dostają laboratoria? Raport na temat opracowania BB, wyjątkowych problemów, interesujących wyników, etc. Świadectwo i raport z oceny Karty kontroli jakości opisujące wpływ temperatury i czasu trwania transportu Z(u)-Wyniki wszystkich pomiarów ujętych w tabeli Z(u)-Wyniki w formie graficznej Warschau Nov. 2008 18

Dr. K. Luden Statystyka DIN 38402-45 Statystyka odpornościowa (bez badania elementów odstających); średnia konsensusu (wykorzystana jako wartość przypisana) obliczona przy pomocy Estymatora Hampela Wartości ZU „normalizują” wyniki porównania różnych poziomów stężenia bakterii Wartości Z: lZUl  2 - wystarczająca lZUl  3 - wątpliwa lZUl > 3 - niewystarczająca m-4,5s m-3s m-1,5s m m+1,5s m+3s m+4,5s Warschau Nov. 2008 19

Świadectwo Nazwa / adres organizatora BB Adres uczestnika Dr. K. Luden Świadectwo Nazwa / adres organizatora BB Adres uczestnika Nr identyfikacyjny BB (np. 3-2008) Tabela parametrów, parametrów oznaczonych prawidłowo oraz użytych metod Podpis organizatora BB Warschau Nov. 2008 20

Grupa B III-2008 E. coli (wartość przypisana 21 CFU/100 ml) Dr. K. Luden BB mikrobiologia ZU-score Labcode Warschau Nov. 2008 21

Międzylaboratoryjne badania porównawcze Dr. K. Luden Międzylaboratoryjne badania porównawcze badania walidacyjne metody: podstawą jest chęć uczestnictwa/kwalifikacje laboratorium materiał referencyjny zgodny z przeznaczeniem w celu certyfikacji materiału referencyjnego: metoda musi być właściwie dobrana do celu/zwalidowana laboratoria eksperckie kontrola jakości / badanie biegłości: testowany jest sposób działania laboratorium, materiał referencyjny i metoda muszą być zwalidowane / zgodne z przeznaczeniem Warschau Nov. 2008 22

E. coli BB 1-2003 Dr. K. Luden Warschau Nov. 2008 23 5 10 15 20 25 30 5 10 15 20 25 30 35 40 45 R 428 3 183 12 162 406 445 543 178 56 340 437 459 219 328 442 469 284 367 460 116 279 149 545 522 391 60 386 36 Labcode E. coli CFU / 100 ml E. coli / 100 ml X-3s X-2s X X+2s X+3s Warschau Nov. 2008 23

Clostridium perfringens Dr. K. Luden Clostridium perfringens PT 2-2004 CFU/100 ml Labcode Warschau Nov. 2008 24

Clostridium perfringens Podłoże / zastosowana metoda Dr. K. Luden Clostridium perfringens Podłoże / zastosowana metoda Stopień odzysku Agar Columbia z krwią / filtracja membranowa 100 % Columbia blood agar / membrane filtration - no shaking of the sample 39 % DEV-Nutrient agar / pour plate method 78 % mCP Agar / Filtration (24 hours TNT) 43 % mCP Agar / Filtration (24 hours 4°C) Agar mCP / filtracja (średnia uczestników BB) 11 % Warschau Nov. 2008 25

Clostridium perfringens Podłoże / zastosowana metoda Dr. K. Luden Clostridium perfringens Podłoże / zastosowana metoda Stopień odzysku Agar Columbia z krwią / filtracja membranowa 100 % Agar Columbia z krwią / filtracja membranowa – bez wstrząsania próby 39 % DEV-Nutrient agar / metoda płytek lanych 78 % mCP Agar / Filtracja (24 godz. TNT) 43 % mCP Agar / Filtracja (24 godz. 4°C) mCP Agar / Filtracja (średnia uczestników BB) 11 % Warschau Nov. 2008 26

Dr. K. Luden Warschau Nov. 2008 27

Pseudomonas aeruginosa Dr. K. Luden Pseudomonas aeruginosa W BB 1-2007 30 % laboratoriów oblało test, ponieważ podały numeryczne wyniki dla P. aeruginosa, podczas gdy przesłany szczep nie był szczepem P. aeruginosa Prawdopodobne wyjaśnienie: problemy z reakcją potwierdzającą – wydzielaniem amoniaku z acetamidu E. coli P. species P. putida Kontrola negat. P. aeruginosa Warschau Nov. 2008 28

E. coli W BB 4-2004 wykorzystano czystą kulturę E. coli Dr. K. Luden E. coli W BB 4-2004 wykorzystano czystą kulturę E. coli Fałszywe wyniki: ISO 9308-1: 2,4 % Colilert®-18: 18,8 % Colilert (n = 80) E. coli Coliformy delta 66 70 4 62 8 74 78 83 9 30 43 13 48 50 2 53 5 3 59 6 19 21 24 25 1 27 45 18 ISO 9308-1 (n = 246) E. coli Coliformy delta 61 68 7 25 30 54 24 15 16 1 21 22 Warschau Nov. 2008 29

Wyjaśnienie? ß-Galactosidase ß-Glucuronidase Dr. K. Luden Warschau Nov. 2008 30

Dr. K. Luden Wnioski Interakcja pomiędzy filtrem, a pożywką agarową może być niekorzystna dla wzrostu organizmu docelowego Należy sprawdzić działanie kombinacji stosowanych materiałów (nawet, jeżeli dostarczane są z odpowiednim certyfikatem) Kontrole negatywne są tak samo ważne, jak pozytywne Badając sprawność laboratorium można dowiedzieć się nowych rzeczy na temat metod .... Warschau Nov. 2008 31

Dr. K. Luden Dziękuję za uwagę! Warschau Nov. 2008 32

Najbardziej prawdopodobne błędy - E. coli / coliformy Dr. K. Luden Najbardziej prawdopodobne błędy - E. coli / coliformy Formalne błędy w wynikach: E. coli zalicza się do grupy coliformów, dlatego liczba E. coli nie może być większa, niż łączna liczba coliformów Komercyjne systemy identyfikacji (które nie powinny być używane podczas BB) mogą dawać sprzeczne wyniki z metodą użytą w BB ISO 9803-1: 44°C wydzielanie indolu, nieprawidłowa lub niewystarczająco precyzyjnie kontrolowana temperatura inkubacji (należy korzystać z kąpieli wodnej) Colilert®-18: pomiary przeprowadzone z zastosowaniem złej długości fali; otwory nie wypełnione prawidłowo. Warschau Nov. 2008 33

Najbardziej prawdopodobne błędy przy liczeniu kolonii Dr. K. Luden Najbardziej prawdopodobne błędy przy liczeniu kolonii Zanieczyszczenie stopionego agaru lub próby Zbyt wysoka temperatura agaru: niewielki wzrost temperatury spowodować może znaczący spadek liczby bakterii zdolnych tworzyć kolonie; zbyt niska temperatura prowadzić może do nierównomiernego rozłożenia bakterii, ponieważ agar się zbryla, co uniemożliwia właściwe mieszanie Zbyt mała ilość agaru Warschau Nov. 2008 34