Toksyczne zakwity cyjanobakterii w Morzu Bałtyckim Seminarium informacyjne dotyczące projektu Ferrybox Toksyczne zakwity cyjanobakterii w Morzu Bałtyckim mgr Katarzyna Sutryk, prof. dr hab. Hanna Mazur-Marzec Uniwersytet Gdański, Instytut Oceanografii Zakład Biologii i Ekologii Morza

Plan prezentacji Zakwity cyjanobakterii w Morzu Bałtyckim Toksyczne gatunki fitoplanktonu pojawiające się w Morzu Bałtyckim Metabolity wtórne wytwarzane przez sinice Metody oraz techniki analizy cyjanotoksyn Toksyny sinicowe w sezonie letnim 2008 i 2009 roku Regulacje prawne

Zakwity organizmów fitoplanktonowych 1. Zakwity cyjanobakterii 3. Metabolity wtórne … 5. Toksyny w sezonie 2008 i 2009 2. Toksyczne gatunki fitoplanktonu … 4. Metody oraz techniki analizy cyjanotoksyn 6. Regulacje prawne Zakwity organizmów fitoplanktonowych W Południowym Bałtyku, morzu silnie zeutrofizowanym, występuje sukcesja gatunków fitoplanktonu w trakcie sezonu wegetatywnego, z silną dominacją sinic w sezonie letnim, co jest typowe dla zbiorników zanieczyszczonych. Sinice są organizmami pionierskimi, zamieszkującymi prawie każdy ekosystem. Mechanizmy adaptacji do warunków środowiska to: wykształcanie wakuol gazowych, posiadanie kilku dodatkowych barwników fikobiliproteinowych, posiadanie wewnętrznych rezerwuarów fosforu asymilacja azotu cząsteczkowego (heterocyty) Niektóre gatunki mogą intensywnie namnażać się, tworząc zakwity. umożliwiających reorientację do optymalnych warunków środowiska, i tworzenie przypowierzchniowych kożuchów umożliwiających wykorzystanie szerokiego spektrum światła (tylko niektóre gatunki, takie jak Nodularia spumigena, Aphanizomenon flos-aquae, Nostoc sp., Anabaena sp., czy Cylindrospermopsis sp., posiadają heterocyty pozwalające na przeprowadzanie tego procesu)

Czynniki sprzyjające powstawaniu zakwitu 1. Zakwity cyjanobakterii 3. Metabolity wtórne … 5. Toksyny w sezonie 2008 i 2009 2. Toksyczne gatunki fitoplanktonu … 4. Metody oraz techniki analizy cyjanotoksyn 6. Regulacje prawne Czynniki sprzyjające powstawaniu zakwitu eutrofizacja niski stosunek azotu do fosforu nasłonecznienie oraz wysoka temperatura wody (15-30°C) utrzymująca się przez dłuższy okres czasu lekki wiatr o prędkości około 4 m/s O zakwicie mówimy gdy: - liczebność jest równa 106 komórek w litrze wody; - biomasa odpowiada 58 mg świeżej masy w 1 litrze wody; - stężenie chlorofilu a np. wynosi powyżej 0,05 mg Chl a na 1 litr wody

Skutki zakwitów sinic Zmniejszenie wartości rekreacyjnej kąpielisk 1. Zakwity cyjanobakterii 3. Metabolity wtórne … 5. Toksyny w sezonie 2008 i 2009 2. Toksyczne gatunki fitoplanktonu … 4. Metody oraz techniki analizy cyjanotoksyn 6. Regulacje prawne Skutki zakwitów sinic - spadek różnorodności gatunkowej powstawanie stref beztlenowych gromadzenie się siarkowodoru przy dnie zmniejszanie przejrzystości wody wysoka wartość produkcji pierwotnej występowanie odorów występowanie TOKSYN Zmniejszenie wartości rekreacyjnej kąpielisk Straty ekonomiczne Zachorowania bydła, zwierząt domowych i ludzi mających kontakt ze skażoną wodą Źródła azotu w Bałtyku: Sinice 180 00 - 370 000 t N/rok Rzeki 480 000 t N/rok Atmosfera 196 000 t N/rok

Potencjalnie toksyczne gatunki fitoplanktonu 1. Zakwity cyjanobakterii 3. Metabolity wtórne … 5. Toksyny w sezonie 2008 i 2009 2. Toksyczne gatunki fitoplanktonu … 4. Metody oraz techniki analizy cyjanotoksyn 6. Regulacje prawne Potencjalnie toksyczne gatunki fitoplanktonu BRUZDNICE SINICE

Metabolity wtórne sinic 1. Zakwity cyjanobakterii 3. Metabolity wtórne … 5. Toksyny w sezonie 2008 i 2009 2. Toksyczne gatunki fitoplanktonu … 4. Metody oraz techniki analizy cyjanotoksyn 6. Regulacje prawne Metabolity wtórne sinic - Nie spełniają żadnej funkcji decydującej o przeżyciu Są uwalniane w trakcie lizy lub starzenia się komórek Są produkowane z monomerycznych substratów, produktów oraz produktów pośrednich metabolizmu pierwotnego Znane toksyny cyjanobakterii Hepatotoksyny Neurotoksyny Dermatotoksyny Cytotoksyny Lipopolisacharydy Inne związki biologicznie aktywne to związki przeciwnowotworowe, przeciwgrzybiczne, antywirusowe, o działaniu antybiotykowym, atraktanty, substancje hormonopodobne i wiele innych

Toksyczność cyjanotoksyn 1. Zakwity cyjanobakterii 3. Metabolity wtórne … 5. Toksyny w sezonie 2008 i 2009 2. Toksyczne gatunki fitoplanktonu … 4. Metody oraz techniki analizy cyjanotoksyn 6. Regulacje prawne Toksyczność cyjanotoksyn Toksyna Wartość LD50 [mg/kg mc] Sposób podania Literatura MC-LR 50-60 dootrzewnowy Chorus i Bartram, 1999 MC-RR 500 anatoksyna-a 100 Fawell i James, 1994 anatoksyna-a(s) 20 Mamood i , 1986 saxitoksyna 10 nodularyna 50 Carmichael i in., 1988 11000 doustny Fawell i in., 1994 5000 Fitzgeorge i in., 1994 saksitoksyna 263 botulina 0,00003 Carmichael, 1975 rycyna 0,02 tetrodotoksyna 8 jad kobry kurrara cyjanek potasu 10000

Hepatotoksyny Najpowszechniej występujące toksyny sinic 1. Zakwity cyjanobakterii 3. Metabolity wtórne … 5. Toksyny w sezonie 2008 i 2009 2. Toksyczne gatunki fitoplanktonu … 4. Metody oraz techniki analizy cyjanotoksyn 6. Regulacje prawne Hepatotoksyny Najpowszechniej występujące toksyny sinic Negatywnie oddziałują na wątrobę, niszcząc jej komórki (hepatocyty) Zaliczamy tu cykliczne peptydy – nodularyny (pentapeptydy) oraz mikrocystyny (heptapeptydy) Cechą kluczową dla aktywności biologicznej tych toksyn jest istnienie b-aminokwasu Adda, który oddziałuje z miejscem katalitycznym fosfataz serynowo/treoninowych Mikrocystyny syntetyzowane są przez wiele gatunków sinic – Microcystis sp., Oscillatoria sp., Anabaena sp., Nostoc sp., Anabaenopsis sp., Haphalosiphon hibernicus, Aphanocapsa sp. Nodularyny są produkowane jedynie przez Nodularia sp. 1988 r. 1959 r.

Stężenie NOD w trakcie zakwitu 0,1 – 10,9 µg/L 1. Zakwity cyjanobakterii 3. Metabolity wtórne … 5. Toksyny w sezonie 2008 i 2009 2. Toksyczne gatunki fitoplanktonu … 4. Metody oraz techniki analizy cyjanotoksyn 6. Regulacje prawne Nodularia spumigena Różnice Budowa Optima warunków środowiska Profile oligopeptydów Cechy wspólne: Obecność aerotopów Biosynteza nodularyny (NOD) Nieznany mechanizm inicjacji i zakończenia zakwitu Akinety? Zakwit Liza komórek przez bakterie i cyjanofagi? NOD > 10.000 – 40.000 × Σ PCB + DDT Szczepy Nodularia NOD Spumiginy Dm NOD mg/g s.m. Ddhb Asp [M+H]+m/z 825 629 643 671 811 N. spumigena NSGG1   2667,4 NSGG2 2567,8 KAC66 2369,9 BY1 136,3 WS609 2954,8 N. spherocarpa Nodularia sp. Stężenie NOD w trakcie zakwitu 0,1 – 10,9 µg/L Najwyższe zmierzone stężenie NOD w fitoplanktonie > 50.000 µg/L

Kumulacja NOD w organizmach Bałtyckich 1. Zakwity cyjanobakterii 3. Metabolity wtórne … 5. Toksyny w sezonie 2008 i 2009 2. Toksyczne gatunki fitoplanktonu … 4. Metody oraz techniki analizy cyjanotoksyn 6. Regulacje prawne Kumulacja NOD w organizmach Bałtyckich 0,003 – 0,19 μg NOD/g 0,1 – 10,9 µg NOD/L TDI  2,4 μg NOD/kg m.c. 0,002 – 0,006 μg NOD/g 0,07 ±0,01 μg NOD/g Max: 2,4 μg NOD/g 0,04 – 0.41 (2,2) μg NOD/g 0,09 – 2,1 μg NOD/g > 0,34 µg NOD/g

Metody oraz techniki analizy cyjanotoksyn 1. Zakwity cyjanobakterii 3. Metabolity wtórne … 5. Toksyny w sezonie 2008 i 2009 2. Toksyczne gatunki fitoplanktonu … 4. Metody oraz techniki analizy cyjanotoksyn 6. Regulacje prawne Metody oraz techniki analizy cyjanotoksyn Próbka środowiskowa Przesączenie próbki przez sączek w włókna szklanego (GF/C 25 mm) Pobranie 1 ml niezatężonej próbki Ekstrakcja komponentów komórek fitoplanktonu – 90% metanol, homogenizacja, sonifikacja próbki, analiza stężenia chlorofilu a ELISA PPIA HPLC LC-MS/MS

Metody fizykochemiczne 1. Zakwity cyjanobakterii 3. Metabolity wtórne … 5. Toksyny w sezonie 2008 i 2009 2. Toksyczne gatunki fitoplanktonu … 4. Metody oraz techniki analizy cyjanotoksyn 6. Regulacje prawne Metody fizykochemiczne HPLC – (Symetry RP-18 column, 125 x 3,9 mm, 5 m; 70% H2O : 30% CH3CN + 0,05% TFA; l=238nm) Analiza jakościowa i ilościowa występujących w próbce toksyn Warunkiem jest posiadanie standardu danej toksyny Rozpoznanie związku zachodzi na podstawie porównania ze wzorcem; analizuje się czas retencji danej toksyny w kolumnie chromatograficznej oraz jej widmo absorpcji LC-ESI-MS/MS (QTOF) – umożliwia analizę jakościową związków obecnych w badanej próbce - Jest wykorzystywana do potwierdzenia struktury związków oznaczonych techniką HPLC

ELISA – test immunoenzymatyczny 1. Zakwity cyjanobakterii 3. Metabolity wtórne … 5. Toksyny w sezonie 2008 i 2009 2. Toksyczne gatunki fitoplanktonu … 4. Metody oraz techniki analizy cyjanotoksyn 6. Regulacje prawne Metody biochemiczne ELISA – test immunoenzymatyczny Sumaryczna, ilościowa analiza wszystkich mikrocystyn oraz nodularyn w próbce Znajduje szerokie zastosowanie w monitoringu środowiskowym i badaniach jakości wody pitnej Dostępny jest w gotowych zestawach (kitach) – w postaci probówek lub mikropłytek z opłaszczonymi przeciwciałami - Granica wykrywalności dla przeciwciał monoklonalnych to 0,2 mg/L PPIA – test inhibicji fosfataz białkowych - Jest testem sprawdzającym toksyczność danej próbki Wykorzystuje się hepatotoksyczne właściwości mikrocystyn oraz nodularyn – aktywność wobec eukariotycznych fosfataz białkowych - Metoda kolorymetryczna pozwalająca na określenie inhibicji fosfatazy białkowej typu PP1, której aktywność jest mierzona na podstawie hydrolizy fosforanu p-nitrofenolu (pNPP) do p-nitrofenylu (pNP) Limit detekcji to 0,3 mg/L

Stężenia nodularyny w roku 2008 i 2009 HPLC 1. Zakwity cyjanobakterii 3. Metabolity wtórne … 5. Toksyny w sezonie 2008 i 2009 2. Toksyczne gatunki fitoplanktonu … 4. Metody oraz techniki analizy cyjanotoksyn 6. Regulacje prawne Stężenia nodularyny w roku 2008 i 2009 HPLC Rok 2008 Rok 2009 ELISA i PPIA – średnio 0,6 mg/L w okresie od 16.06 do 08.07

Porównanie różnych metod analizy cyjanotoksyn 1. Zakwity cyjanobakterii 3. Metabolity wtórne … 5. Toksyny w sezonie 2008 i 2009 2. Toksyczne gatunki fitoplanktonu … 4. Metody oraz techniki analizy cyjanotoksyn 6. Regulacje prawne 16.06.2009 Porównanie różnych metod analizy cyjanotoksyn Nawet tam gdzie nie było toksyn, fosfatazy daly wynik pozytywny

1. Zakwity cyjanobakterii 3. Metabolity wtórne … 5. Toksyny w sezonie 2008 i 2009 2. Toksyczne gatunki fitoplanktonu … 4. Metody oraz techniki analizy cyjanotoksyn 6. Regulacje prawne 02.07.2009 najwyższe stężenie nodularyny (HPLC) w sezonie letnim roku 2009 zostało obliczone dla stacji GK6 2,19 mg/L

1. Zakwity cyjanobakterii 3. Metabolity wtórne … 5. Toksyny w sezonie 2008 i 2009 2. Toksyczne gatunki fitoplanktonu … 4. Metody oraz techniki analizy cyjanotoksyn 6. Regulacje prawne Porównanie biomasy sinic obliczonej dla promu i statku badawczego Oceanograf, 21.07.2008

1. Zakwity cyjanobakterii 3. Metabolity wtórne … 5. Toksyny w sezonie 2008 i 2009 2. Toksyczne gatunki fitoplanktonu … 4. Metody oraz techniki analizy cyjanotoksyn 6. Regulacje prawne Regulacje prawne Dyrektywa 2000/60/WE 23.X.2000 (Ramowa Dyrektywa Wodna) – ustalenie ram dla działalności Wspólnoty w dziedzinie polityki wodnej ochrona, podnoszenie wartości oraz odnawianie wszystkich zasobów powierzchniowych (w tym silnie zdegenerowanych zbiorników wodnych) WHO, 1998 – ustalenie dopuszczalnego stężenia mikrocystyny MC-LR w wodzie pitnej – 1 mg/dm3 Rozporządzenie Ministra Zdrowia z dnia 19 listopada 2002 – do wymagań dotyczących właściwości fizykochemicznych wody dołączono wskazania odnośnie stężenia MC-LR (limit 1 mg/dm3). Rozporządzenie to było aktualne do 17 sierpnia 2006 WHO, 2003 – ustalenie trzystopniowego systemu alarmów dla zbiorników służących celom rekreacyjnym, na podstawie stężenie chlorofilu a i liczebności komórek sinic. Niskie ryzyko dla ekosystemu i ludzi występuje przy stężeniu 4 mg/dm3 Rozporządzenie Ministra Zdrowia z dnia 6 kwietnia 2007 – brak zaleceń dotyczących MC-LR Dyrektywa 2006/7/WE Parlamentu Europejskiego – zarządzanie jakością wody w kąpieliskach. Profil wody powinien zawierać między innymi możliwości rozmnażania sinic, makroalg i fitoplanktonu. Brak wskazań do monitorowania poszczególnych toksyn. WHO, 2008 – utrzymanie dopuszczalnej dawki dla MC-LR

Seminarium informacyjne dotyczące projektu Ferrybox Dziękuję za uwagę! ?