MONITOROWANIE POZOSTAŁOŚCI FARMACEUTYKÓW W ŚRODOWISKU WODNYM Justyna Płotka Maria Radziszowska Joanna Reszczyńska

Szczegółowa analiza chemiczna wody jest warunkiem niezbędnym, aby zapewnić bezpieczeństwo korzystania z zasobów wodnych. Ograniczenia w możliwościach identyfikacji wszystkich zanieczyszczeń występujących w wodzie uniemożliwia pełną ocenę jej jakości i przewidywanego jej oddziaływania na człowieka. W chwili obecnej problem pojawiania się pozostałości środków farmaceutycznych w poszczególnych elementach środowiska stanowi nowe wyzwanie zarówno dla technologii oczyszczania wód i ścieków, jak i dla analityków, których zadaniem jest opracowanie nowych metodyk analitycznych.

Historia 1981 Stwierdzenie obecności oraz ilościowe oznaczenie kwasu klofibrowego w próbkach środowiskowych (USA) 1997 Oznaczanie pozostałości farmaceutyków w ściekach w szpitalach (Niemcy) 1997 Badanie dotyczące toksyczności antybiotyków w środowisku wodnym (Dania) 1998 Monitorowanie wód rzecznych i ścieków w Niemczech na obecność pozostałości farmaceutyków (Niemcy) 1999 Opracowanie metodyki analitycznej umożliwiającej stwierdzenie obecności estragonów w wodach powierzchniowych (USA) 2002 Pierwsza metodyka jednoczesnego oznaczania pozostałości wielu farmaceutyków w próbkach środowiskowych (Dania) Oznaczanie pozostałości farmaceutyków w wodach pitnych (Niemcy) 2003 Opracowanie odpowiednich modeli matematycznych do przewidywania stężenia i losu poszczególnych farmaceutyków w środowisku (Belgia) 2005 Oznaczanie pozostałości farmaceutyków próbkach stałych (Hiszpania)

Ustawodawstwo jest główną siłą napędzającą rozwój analityki i monitoringu środowiskowego. Naukowcy zajmujący się analityką środowiskową skupiają się na badaniu tych związków chemicznych, których obecność w środowisku została prawnie uregulowana przez różne organy ustawodawcze. Rozwój nowych czulszych technik wykrywania i oznaczania związków chemicznych i określania ich efektów biologicznych, skierował uwagę naukowców ku innym zanieczyszczeniom, które dotychczas nie podlegały ścisłym uregulowaniom prawnym, bądź też szybciej nie zostały uznane za niebezpieczne. Są to zanieczyszczenia definiowane jako szybciej nie zidentyfikowane lub wcześniej nierozpoznane i należą do nich też farmaceutyki. Antybiotyki stanowią największy problem, a to ze względu na ich potencjalny wpływ na genetyczne zmiany opornych im bakterii oraz związki zakłócające równowagę hormonalną, z powodu potencjalnego wywoływania efektu estrogennego.

Akty prawne Prawo wodne: Dz.U nr 137 poz. 984 Rozporządzenie Ministra Środowiska z dnia 24 lipca 2006 r. w sprawie warunk ó w, jakie należy spełnić przy wprowadzaniu ściek ó w do w ó d lub ziemi, oraz w sprawie substancji szczeg ó lnie szkodliwych dla środowiska wodnego Dz.U nr 233 poz Rozporządzenie Ministra Środowiska z dnia 10 listopada 2005 r. w sprawie substancji szczeg ó lnie szkodliwych dla środowiska wodnego, kt ó rych wprowadzenie w ściekach przemysłowych do urządzeń kanalizacyjnych wymaga uzyskania pozwolenia wodnoprawnego. Dz. U. z dnia 31 marca 2003 r Rozporządzenie Ministra Rolnictwa i Rozwoju Wsi w sprawie badań kontrolnych pozostałości chemicznych, biologicznych, lek ó w i skażeń promieniotw ó rczych u zwierząt żywych, w tkankach lub narządach zwierząt po uboju i w produktach spożywczych pochodzenia zwierzęcego

Klasyfikacja substancji leczniczych Leki działające na ośrodkowy układ nerwowy Leki wpływające na obwodowy układ nerwowy Autakoidy (mediatory) Leki działające na układ krążenia i wpływające na krzepliwość krwi Leki moczopędne (diuretyki) Leki stosowane w chorobach układu oddechowego Leki stosowane w chorobach układu pokarmowego Hormony Leki działające na drobnoustroje chorobotwórcze Witaminy Leki przeciwnowotworowe Leki immunotropowe

Liczba opakowań leków rocznie kupowanych przez statystycznego mieszkańca wybranych krajów

Dlaczego tak dużo pozostałości farmaceutyków w wodzie? Produkcja preparatów farmaceutycznych i oddziaływanie na środowisko zakładów przemysłu farmaceutycznego Zrzucanie do środowiska dużych ilości przeterminowanych środków zarówno z gospodarstw domowych, jak i ze ściekami i odpadami szpitalnymi Wydalanie pozostałości leków i ich metabolitów przez ludzi i zwierzęta

Drogi obiegu i przedostawania się farmaceutyków do środowiska Większość leków ulega w ustroju biotransformacji, która prowadzi do przekształcenia związków lipofilnych i apolarnych w związki hydrofilne i polarne, ponieważ tylko takie związki mogą być wydalone przez nerki - główną drogę usuwania leków z organizmu. Biotransformacja przebiegająca przede wszystkim w wątrobie prowadzi najczęściej do utraty aktywności farmakologicznej leku. Aktywność enzymów uczestniczących w tym procesie jest uwarunkowana gatunkowo, zależy od płci (większość leków jest szybciej metabolizowana u mężczyzn), wieku, stanu fizjologicznego, stanu chorobowego oraz obecności w ustroju inhibitorów enzymatycznych, które hamują metabolizm leków, i induktorów enzymatycznych, które wzmagają biotransformację leków. Niektóre leki (np. fenylobutazon, barbiturany, morfina, nikotyna) posiadają właściwość samoindukcji - wzmagania własnego metabolizmu przy przewlekłym ich stosowaniu (jest to główna przyczyna wytwarzania się tolerancji na leki).

Przewidywane drogi przedostawania się do środowiska farmaceutyków zawartych w wodzie wychodzącej z oczyszczalni ścieków Przemysł farmaceutyczny Medycyna Wetyrynaria Rolnictwo NawozyGleba Oczyszczalnie scieków Ścieki po oczyszczaniu Odpady Składowiska odpadów Woda pitnaWoda gruntowa Woda odpływowa

Skutki obecności pozostałości leków w wodzie pitnej Korzystanie z wody zanieczyszczonej przez pozostałości farmaceutyków i ich metabolity zaburza równowagę w organizmie Podawane codziennie nawet śladowe dawki leków, mogą uszkadzać komórki mózgu, wpływać na zachowanie, zaburzać gospodarkę hormonalną człowieka nawet małe ilości niektórych lekarstw mogą przyspieszać wzrost nowotworów Potęguje problem zjawiska lekooporności Efekty obecności leków w wodzie mogą się ujawnić dopiero za kilkadziesiąt lat!!!

Gdzie się monitoruje? Woda rzeczna Odpływy oczyszczalni ścieków Woda stojąca Dopływy oczyszczalni ścieków Osady denne rzeczne Woda ze strumieni Woda pitna Wody gruntowe

Przygotowanie próbek do analizy Dzięki opracowywaniu i wprowadzaniu do praktyki coraz to nowszych procedur analitycznych, możliwe jest oznaczenie śladowych i ultraśladowych ilości analitów nawet przy bardzo złożonej matrycy. Osiągnięcia metodyczne w tym zakresie mają kluczowe znaczenie do rozwiązania wielu problemów z zakresu poznania: poziomów stężeń farmaceutyków i ich metabolitów w poszczególnych elementach środowiska; dróg przemieszczania się farmaceutyków w środowisku; procesów metabolizmu środków leczniczych; skuteczności procesów utylizacji odpadów farmaceutycznych oraz oczyszczania ścieków zawierających substancje z tej grupy zanieczyszczeń

Każda procedura analityczna składa się z wielu wzajemnie zależnych operacji, które powinny być dokładnie zaplanowane. Wtedy wynik końcowy odzwierciedla rzeczywistą zawartość oznaczanej substancji w próbce. Pobrane próbki poddawane są (albo w warunkach in situ albo w laboratorium) kolejnym operacjom. Typowe postępowanie analityczne składa się z następujących etapów: Konserwacja próbek, Izolacja i/lub wzbogacanie analitów, Transport i przechowywanie próbek lub uzyskanych ekstraktów, Oczyszczanie i ewentualne zmniejszanie objętości ekstraktów

Do najczęściej stosowanych technik izolacji i wzbogacenia próbek wodnych związków pochodzenia farmaceutycznego należą: ekstrakcja do fazy stałej (SPE); mikro ekstrakcja do fazy stacjonarnej (SPME); ekstrakcja ciecz—ciecz (LLE); ekstrakcja za pomocą płynu w stanie nadkrytycznym (SFE) do izolacji wybranych farmaceutyków z wody (m.in. diazepam, oksazepam, testosteron. naproksen, indometacyna, ketoprofen, tolmetin); ekstrakcja za pomocą strumienia gazu

SPE – ekstrakcja do fazy stałej Polega na zaadsorbowaniu na stałym sorbencie składników próbki a następnie wymyciu ich z jego powierzchni za pomocą odpowiedniego rozpuszczalnika. Ekstrakcja jest przeprowadzana w specjalnych polipropylenowych lub szklanych kolumnach na dyskach ( krążkach )

Zalety i wady SPE Możliwość przechowywania analitów zatrzymanych na sorbencie przez długi czas Szeroki wybór sorbentów Małe zużycie stosowanych rozpuszczalników Możliwość izolowania i wzbogacania analitów lotnych i nie lotnych Prostota wykonania Nieskomplikowana aparatura Zatykanie złoża lub blokowanie porów sorbentu przez zawiesiny obecne w próbce Wpływ oddziaływań między matrycą a sorbentem na odzyski analizowanych związków

SPME – mikro ekstrakcja do fazy stacjonarnej Metoda wydzielania substancji z próbek wodnych (w których mogą być obecne małe ilości rozpuszczalników organicznych), polegająca na podziale substancji pomiędzy fazę z której wydzielane są składniki, a fazę stacjonarną umieszczoną na cienkim włóknie szklanym lub kwarcowym. Przyrząd do mikroekstrakcji zawiera cienki drut stalowy, który jest przedłużony włóknem o właściwościach sorpcyjnych (długość włókna wynosi ok.1 cm). Drut ten jest przesuwany wewnątrz igły mikro strzykawki. Włókno może być pokryte żelem krzemionkowym albo cienką warstwą cieczy o małej lotności, trudno rozpuszczalnej w matrycy I etap – włókno jest doprowadzone do kontaktu z próbką w fazie gazowej lub w fazie ciekłej (najczęściej) w wyniku czego dochodzi do sorpcji analitów II etap – włókno jest wystawiane na działanie wysokiej temperatury w gorącym dozowniku chromatografu gazowego, a uwolnione anality przenoszone są do kolumny chromatograficznej

Zalety SPME Szybkość (2 – 30 minut) Czułość –granica wykrywalności może osiągnąć poziom ppt Ekonomia – zminimalizowane koszty rozpuszczalników, włókno można wykorzystywać ok. 100 razy Uniwersalność – możliwość stosowania z dowolnym chromatografem gazowym lub dowolnym zestawem HPLC posiadającym przystawkę SPME/HPLC do dozowania próbek Możliwość ekstrakcji w wielu różnych matryc Możliwość automatyzacji

LLE – ekstrakcja ciecz- ciecz Najczęściej wykorzystywana metoda przygotowania próbek do analizy chromatograficznej. Związki analizowane wydzielane są z matrycy kilkoma mililitrami rozpuszczalnika organicznego, który nie rozpuszcza się w tej matrycy.

Zalety i wady LLE Zminimalizowana adsorpcja zanieczyszczeń na ściankach Łatwa realizacja Użycie dużej ilości drogich rozpuszczalników (wysoka czystość rozpuszczalników) Długi czas cyklu analitycznego Trudności z automatyzacją procesu przygotowania próbek Słaba precyzja i powtarzalność ekstrakcji

SFE – ekstrakcja za pomocą płynu w stanie nadkrytycznym Ekstrakcja za pomocą płynu w stanie nadkrytycznym jest techniką stosowaną do wzbogacania analitów z próbek stałych

Zalety i wady SFE Jedną z największych zalet niespotykaną w innych technikach jest możliwość całkowitej kontroli nad właściwościami ekstrakcyjnymi płynu w stanie nadkrytycznym, dzięki czemu mamy możliwość wpływu na przebieg tego procesu- również w trakcie jego trwania Możliwość całkowitego przeniesienia analitów z próbki do układu rozdzielającego znacząco obniżaja granice wykrywalności techniki Brak rozpuszczalników Nieskomplikowane oprzyrządowanie Możliwość analizy próbek w układzie on-line Ograniczony zakres jej stosowalności ( anality lub ich pochodne powinny odznaczać się odpowiednią lotnością – wyklucza się substancje o wysokich masach cząsteczkowych) Ograniczony repertuar odczynników derywatyzujących (Derywatyzacja - przeprowadzenie trudno lotnych związków w ich lotne i trwałe pochodne (dla celów GC i GC/MS ) Matryca próbki, która może zawierać substancje powodujące pienienie się roztworu podczas ekstrakcji

METODY OZNACZEŃ KOŃKOWYCH W PRÓBKACH ŚRODOWISKOWYCH Oznaczanie farmaceutyków w próbkach środowiskowych wymaga zastosowania bardzo czułych i selektywnych technik oznaczeń końcowych: Wysokosprawna chromatografia cieczowa – HPLC Chromatografia gazowa – GC Chromatografia cieczowa – LC

RODZAJE STOSOWANYCH DETEKTORÓW Nieodzownym i bardzo ważnym elementem urządzenia analitycznego jest odpowiedni detektor. Najczęściej stosowane przy zastosowaniu HPLC i GC są: Spektrometr mas –MS (najczęściej wykorzystywany) Detektor płomieniowo – jonizacyjny – FID Spektrofotometr z matrycą diodową – DAD Detektor fluorescencyjny - FLD

DLACZEGO TECHNIKI SĄ ŁĄCZONE? Identyfikacja na podstawie czasów retencji nie jest już wystarczająca Problem nakładania się pików Identyfikacja nieznanych substancji Techniki łączone umożliwiają identyfikację nieznanych substancji, informują o ich masie i strukturze. Ponadto szybciej uzyskuje się wynik końcowy i łatwo jest wykryć fakt nakładania się pików.

W chwili obecnej najwłaściwszą techniką oznaczania polarnych zanieczyszczeń środowiskowych na poziomie śladowym (a więc m.in. leków) jest chromatografia cieczowa sprzężona ze spektrometrem mas LC-MS lub tandemową spektrometrią mas LC-MS-MS.

GC-MS Chromatograf rozdziela analizowaną próbkę na pojedyncze związki chemiczne, które są kolejno kierowane do spektrometru mas celem ich jednoznacznej identyfikacji

GC-MS Chromatograf gazowy ze spektrometrem mas w roli detektora znalazł szerokie zastosowanie w analizie organicznych zanieczyszczeń środowiska, gdyż spektrometr ten pozwala na : Uzyskanie informacji jakościowej o rozdzielanych związkach Zapewnienie specyficzności oznaczeń ilościowych

GC-MS Wykorzystując technikę GC–MS oznaczono w próbkach wody takie substancje pochodzenia farmaceutycznego jak: Kwas salicylowy Ibuprofen Naproksen

HPLC-MS Połączenie wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej (HPLC) ze spektrometrią masową łączy zalety obu technik. Podstawowe zalety: zwiększona czułość analizy (próbka zagęszczona na kolumnie chromatograficznej, unikanie strat związanych z przenoszeniem próbki), duża oszczędność analizowanego materiału bezpośrednia analiza skomplikowanych mieszanin niewielkie zużycie elementów ze względu na specyfikę stosowanych kolumn chromatograficznych.

HPLC-MS Wysokociśnieniowe chromatografy cieczowe (HPLC) są łączone ze spektrometrami mas. Najczęściej stosowanym w tym przypadku źródłem jonów jest elektrorozpylacz (ESI). W układach tych stosuje się często spektrometry tandemowe ze względu na dużą złożoność analizowanych próbek. Technika ta jest stosowana do końcowego rozdzielania oraz analizy ilościowej i jakościowej analitów wydzielonych z próbek środowiskowych

HPLC-MS Za pomocą chromatografii cieczowej sprzężonej z spektrometrem mas można oznaczać takie substancje jak: Naproksen Antybiotyki (penicylina,tetracykliny)

LC-MS LC-MS/MS Przy oznaczaniu środków farmaceutycznych z wykorzystaniem techniki LC-MS czy też LC- MS/MS najodpowiedniejszym sposobem jonizacji jest technika ESI lub też technika APCI Za pomocą tej techniki można oznaczyć min.: paracetamol, kwas klofibrynowy

ESI ( ESI ) Elektrorozpylanie - to jedna z nowszych metod jonizacji próbki w spektrometrii masowej. Odbywa się ona przez rozpylenie w polu elektrycznym (zwykle kV) pod ciśnieniem atmosferycznym. Jest stosowana w przypadku oznaczania związków polarnych

ESI Podstawowe zalety metody ( ESI )to: minimalna fragmentacja próbki podczas jonizacji, wysoka czułość oznaczeń ( większa niż w APCI) kompatybilność z technikami chromatograficznymi (HPLC) oraz elektroforetycznymi (CE), możliwość analizy dużych cząsteczek (do ok Da).

APCI Próbka ulega jonizacji chemicznej pod ciśnieniem atmosferycznym przy użyciu napięcia rzędu V. Stosowana jest w przypadku oznaczania związków o średniej i słabej polarności

Wpływ leków na środowisko Korzystanie z wody zanieczyszczonej przez pozostałości leków i ich metabolity: zaburza równowagę w organizmie Potencjalnie wywołują efekt estrogenny, prowadzący do feminizacji czy obojnactwa organizmów wodnych, a w efekcie końcowym-także organizmu człowieka potęguje problem lekooporności Związki zakłócające równowagę hormonalną Leki i ich metabolity, które są trwałe i polarne nie będą zatrzymywane ani też degradowane w oczyszczalni ścieków i tym samym mogą łatwo migrować do środowiska wodnego

PODSUMOWANIE W Polsce jak dotąd nie stworzono żadnych regulacji prawnych dotyczących dopuszczalnych stężeń danego farmaceutyku w środowisku. Antybiotyki powinny być stosowane w medycynie, weterynarii i rolnictwie tylko w uzasadnionych przypadkach Obecnie prowadzone są badania nad wykorzystaniem metod typu membranowego do oczyszczania ścieków zawierających farmaceutyki, jednak jak na razie, badania prowadzone są w warunkach laboratoryjnych

Badania nad toksycznością leków dla środowiska prowadzi się w Polsce od ok. 10 lat. Wiemy już, jakie zmiany powodują, natomiast nie znamy odległych skutków tych zmian. Nie wiemy też, jak natura sobie z nimi poradzi Jeśli okaże się, że jakieś lekarstwo jest bardzo toksyczne dla środowiska, można zacząć je eliminować i zastępować tymi, które są mniej toksyczne

Przeterminowane leki wymagają specjalnego deponowania na składowiskach odpadów niebezpiecznych lub powinny być poddane termicznej utylizacji Przeterminowane leki przekazane do kontrolowanych punktów zbiórki, zamiast do środowiska lub w niepowołane ręce, trafią do unieszkodliwienia.