Określanie mechanizmów reakcji enzymatycznych Enzymologia-5 Określanie mechanizmów reakcji enzymatycznych

Najważniejsze metody badania mechanizmów reakcji Określanie struktury enzymu Modyfikacja chemiczna enzymu Ukierunkowana mutageneza genu kodującego enzym Detekcja intermediatów reakcji enzymatycznej Badanie kinetyki reakcji enzymatycznej

Zastosowanie badań strukturalnych do określania mechanizmów reakcji Metody: niskotemperaturowa rentgenografia strukturalna, NMR Szczególne znaczenie – określanie struktury kompleksu enzymu z analogiem substratu lub analogiem stanu przejściowego Struktura kompleksu hydroksymetylotransferazy serynowej z adduktem substratu z koenzymem oraz analogiem drugiego substratu

Reakcja katalizowana przez karbamoilotransferazę asparaginianową Stan przejściowy Analog stanu przejściowego

Struktura kompleksu karbamoilotransferazy asparaginianowej z PALA

MODYFIKACJE CHEMICZNE ENZYMU Działanie na enzym związkiem chemicznym powodującym inaktywację Dwa podejścia: odczynniki specyficzne wobec grup funkcyjnych określonych reszt aminokwasowych; analogi substratu lub stanu przejściowego reakcji enzymatycznej zawierające reaktywne ugrupowania chemiczne (ang. affinity labeling) Cechy odczynnika modyfikującego: selektywne zablokowanie określonej grupy funkcyjnej charakter lokalny zmiany ograniczenie zawady przestrzennej

MODYFIKACJE CHEMICZNE ENZYMU Pojęcie reszty istotnej dla aktywności enzymu modyfikacja chemiczna reszty powoduje całkowitą utratę aktywności przez enzym; stechiometria inaktywacji 1 : 1; substrat lub inhibitor kompetytywny chronią enzym przed inaktywacją

Kinetyka inaktywacji enzymu ln[Ea]t/[Ea]o t [Io] [I] > [Io] [I] < [Io] kobs [I] tga = k1

kobs [I]

Odczynniki reagujące specyficznie z łańcuchami bocznymi niektórych reszt aminokwasowych.

MODYFIKACJE CHEMICZNE ENZYMU  Odczynniki ukierunkowane na reszty cysteinylowe   A. -halogenooctany i -halogenoacetamidy Warunki: pH  7; labilne w roztworach wodnych; reaktywność I>Br>>Cl; dla jodopochodnych rekcję należy prowadzić w ciemności B. N-podstawione imidy kwasu maleinowego Warunki: pH  7; możliwość śledzenia zaniku absorpcji przy  = 302 nm; dla NEM  = 620 M-1cm-1

C. Kwas 2-nitro-5-tiocyjanobenzoesowy Warunki: pH = 8.0; niezbyt duże nadmiary molowe odczynnika (1,5  do 2 ); dla wytworzonej S-cyjanopochodnej max = 330 nm,  = 7500 M-1cm-1   D. Odczynnik Ellmana – kwas 5,5’-ditiobis(5-nitrobenzoesowy) Używany do ilościowego oznaczania grup tiolowych.

MODYFIKACJE CHEMICZNE ENZYMU  Odczynnik ukierunkowany na reszty serylowe    Fluorek fenylometylosulfonylu (PMSF)

MODYFIKACJE CHEMICZNE ENZYMU  Odczynniki ukierunkowane na reszty lizylowe    A. Imidoestry Warunki: długie czasy reakcji  B. Kwas 2,4,6-trinitrobenzenosulfonowy Warunki: Barwny produkt podstawienia; max = 420 nm,  = 20 000 M-1cm-1

C. Fosforan pirydoksalu   Warunki: najwyższa selektywność; wytworzenie trwałego wiązania dopiero w wyniku redukcji zasady Schiffa; reakcję należy prowadzić w ciemności; cyjanoborowodorek preferowany wobec borowodorku bo można prowadzić reakcję w roztworze wodnym (uwaga: tylko w pH >7!)

MODYFIKACJE CHEMICZNE ENZYMU   Odczynniki ukierunkowane na reszty histydylowe A. Dietylopirowęglan Warunki: odczynnik specyficzny dla His w zakresie pH4,5 – 7; produkt modyfikacji absorbuje w UV - max = 240 nm,  = 3200 M-1cm-1; odczynnik nietrwały w roztworach wodnych; w pH 7 czas połowicznego rozpadu = 10 min; im niższe pH tym większa trwałość odczynnika

B. Róż Bengalski – odczynnik fotoutleniający   Warunki: ograniczona specyficzność (możliwe utlenienie Cys, Met i Trp); reakcję prowadzi się w temp 0 - 4C naświetlając promieniowaniem w zakresie VIS

MODYFIKACJE CHEMICZNE ENZYMU   Odczynniki ukierunkowane na reszty tyrozylowe A. N-acetyloimidazol Warunki: duże nadmiary odczynnika. Unikać buforu Tris. Reakcja dość wolna  B. Tetranitrometan Warunki: można śledzić postęp reakcji przy  = 350 nm,  = 14.400 M-1cm-1 (anion trinitrokarboniowy). Może zachodzić utlenienie cysteiny.

MODYFIKACJE CHEMICZNE ENZYMU  Odczynniki ukierunkowane na reszty tryptofanylowe   A. N-bromoimid kwasu bursztynowego Warunki: reakcja w buforze octanowym; gwałtowny przebieg; ograniczona specyficzność (ulegają też Tyr, Cys. Met) B. Bromek 2-hydroksy-5-nitrobenzylu (BHNB) C. Sól dimetylosulfoniowa BHNB odczynnik rozpuszczalny w wodzie Warunki: duże nadmiary odczynnika (nawet 100 ); reakcja w ciemności; odczynnik słabo rozpuszczalny w wodzie  

MODYFIKACJE CHEMICZNE ENZYMU Odczynniki ukierunkowane na reszty Glu i Asp   A. Rozpuszczalne w wodzie pochodne karbodiimidu Schemat przebiegu reakcji Warunki: reakcja specyficzna w pH 4 – 6; duże nadmiary odczynnika; jako aminę stosuje się najczęściej ester metylowy glicyny; w kwaśnym pH konkurencyjna reakcja hydrolizy jest bardzo wolna.

Izomeraza fosfotriozowa HIS95 N Lys12 NH3+ Glu165 O H HIS95 N + H-N Lys12 NH3+ Glu165 HIS95 N + H-N Lys12 NH3+ Glu165

MODYFIKACJE CHEMICZNE ENZYMU Izomeraza fosfotriozowa

Mutageneza ukierunkowana Mutageneza to proces prowadzący do powstania mutacji, czyli dziedziczonej zmiany sekwencji nukleotydowej DNA Mutageneza ukierunkowana jest techniką umożliwiającą precyzyjne badanie białek: umożliwia zrozumienie, w jaki sposób białka ulegają fałdowaniu jak rozpoznają inne cząsteczki, katalizują reakcje. W przypadku ustalania aminokwasów biorących udział w funkcji katalitycznej, czy regulacyjnej enzymu jest to najlepsza metoda udowadniająca lub obalająca udział konkretnych aminokwasów w pełnieniu tych funkcji.

Zastosowanie ukierunkowanej mutagenezy do identyfikacji reszt istotnych dla aktywności enzymu Enzym syntaza GlcN-6-P Struktura przestrzenna enzymu Analiza porównawcza sekwencji syntazy GlcN-6-P z różnych źródeł podstawą selekcji reszt do ukierunkowanej mutagenezy

Zastosowanie ukierunkowanej mutagenezy do identyfikacji reszt istotnych dla aktywności enzymu Enzym syntaza GlcN-6-P Aktywność glutaminazowa: L-Gln + H2O  L-Glu + NH3 Aktywność izomerazowa: Fru-6-P  Glu-6-P Aktywność syntazowa: L-Gln + Fru-6-P  L-Glu + GlcN-6-P

Detekcja intermediatów Niektóre produkty przejściowe reakcji enzymatycznej są stosunkowo stabilne (głębokie minimum energetyczne) – istnieje możliwość detekcji metodami spektroskopowymi: spektrofluorymetria, NMR niskotemperaturowy; Początkowe etapy reakcji katalizowanej przez chymotrypsynę Wyłapywanie intermediatów za pomocą reakcji chemicznej Redukcja produktu przejściowego w postaci zasady Schiffa prowadzi do powstania stabilnego adduktu

Informacje dotyczące mechanizmu działania enzymu, które można uzyskać z pomiarów kinetycznych Eksperyment Możliwe informacje Określanie zmian szybkości reakcji w zależności od stężenia substratu Określanie zależności parametrów kinetycznych od struktury substratu Inhibicja odwracalna Określanie zależności aktywności od zmian pH Badania kinetyki stanu nieustalonego Wyznaczanie parametrów kinetycznych; rozróżnianie mechanizmów reakcji dwusubstratowych Rozpoznanie czynników strukturalnych odpowiedzialnych za wiązanie substratu Informacje pomocne dla określenia struktury centrum aktywnego Określenie pKa reszt istotnych dla katalizy Wyznaczenie stałych szybkości etapów reakcji: detekcja kompleksów enzymu z substratem i/lub produktami przejściowymi

Zależność aktywności enzymu od zmian struktury substratu Papaina – proteinaza cysteinylowa Ala-Phe-Arg-Leu Ala-Phe-Arg Badania specyficzności substratowej papainy wobec syntetycznych oligopeptydów wykazały istnienie w centrum wiążącym substrat obecność 7 „subcentrów” S2 – specyficzne wobec L-Phe S1’ – stereospecyficzne dla L-aminokwasów, z preferencją dla L-Leu i L-Trp Tripeptyd Ala-Phe-Arg jest inhibitorem kompetytywnym enzymu Czy tetrapeptyd Ala-Phe-Arg-Leu jest także inhibitorem?

Zależność zmian aktywności enzymu od pH Analiza kształtu zależności v = f(pH) daje możliwość wyznaczenia pKa reszt ulegających jonizacji, które są istotne dla aktywności enzymu Krzywa dzwonowa pH optimum = pKa reszty katalitycznej

-CO2H -COO- + H+ -ImH+ -Im + H+ Analiza zależności pKa reszt jonizujących od polarności rozpuszczalnika pozwala na określenie stanu jonizacji reszty -CO2H -COO- + H+ W tym przypadku obniżenie polarności rozpuszczalnika jest niekorzystne dla dysocjacji. pKa rośnie przy obniżaniu polarności. -ImH+ -Im + H+ A jak w tym przypadku?

Kinetyka stanów nieustalonych Schemat aparatury do pomiarów kinetycznych metodą stopped flow

Kinetyka stanów nieustalonych Warunki pomiaru: stężenia enzymu i substratu na porównywalnym poziomie techniki pomiarowe umożliwiające określanie niewielkich zmian stężenia w krótkim czasie (ang. stopped flow) Przykład: reakcja wiązania NADH przez dehydrogenazę mleczanową. Pomiar zmian stężenia NADH metodą spektrofluorymetryczną przez 16 ms; Stężenia początkowe enzymu i NADH identyczne – 8 M. k1 E + NADH [E:NADH] k-1 Reakcja II rzędu, ale ponieważ [E] = [S], to połowiczny czas reakcji można wyrazić wzorem:  = 1/k [S]. Z eksperymentu otrzymano  = 2 ms k = 1/ [S] = 6,7  107 M-1 s-1 Ponieważ k1 >> k-1, to k = k1

Chymotrypsyna – triada katalityczna

Kinetyka hydrolizy octanu p-nitrofenylu przez chymotrypsynę Faza I – tworzenie produktu przejściowego - acyloenzymu Faza II – hydroliza produktu przejściowego