Pobierz prezentację
Pobieranie prezentacji. Proszę czekać
1
Wpływ per[2,3,6-tri-O-(2’-metoksy)etylo]-α-cyklodekstryny na katalityczną aktywność L-tryptofan indol liazy Praca magisterska wykonana w Pracowni Węglowodanów, Wydział Chemii, Uniwersytet Warszawski Maciej Rackiewicz Promotor: prof. dr hab. Andrzej Temeriusz Opiekun: mgr Tomasz Gubica Cele pracy: 1. Synteza i oczyszczenie czterech związków: - Heksakis-(2,3,6-tri-O-metylo)-α-cyklodekstryna - Heptakis-(2,3,6-tri-O-metylo)-β-cyklodekstryna - Oktakis-(2,3,6-tri-O-metylo)-γ-cyklodekstryna - Per[2,3,6-tri-O-(2’-metoksy)etylo]-α-cyklodekstryna 2.Zbadanie wpływu jaki wywiera dodatek otrzymanych związków na aktywność enzymu L-tryptofan indol liazy w reakcjach enzymatycznych Wstęp Cyklodekstryny są to cykliczne oligosacharydy zawierające 6, 7 lub 8 jednostek α-1,4-D-glukopiranozowych nazwane odpowiednio α, β i γ-cyklodekstrynami. Cyklodekstryny zostały odkryte i wyizolowane przez Villiersa w 1891 roku w reakcji degradacji skrobi. Cząsteczka cyklodekstryny ma kształt ściętego stożka o otwartych obu końcach gdzie drugorzędowe grupy hydroksylowe przy C-2 i C-3 zorientowane są przy grubszym końcu stożka natomiast pierwszorzędowe grupy hydroksylowe (C-6) przy cieńszym końcu. Wnętrze cząsteczki jest hydrofobowe natomiast powierzchnia zewnętrzna jest hydrofilowa dzięki czemu cyklodekstryny mają zdolność kompleksowania związków organicznych w swojej wnęce. Właściwości te zainspirowały wielu naukowców do badań nad wykorzystaniem tych związków w wielu dziedzinach chemii. Schematy reakcji: Badania enzymatyczne: Charakterystyczna zdolność cyklodekstryn do inkludowania wielu związków organicznych wewnątrz hydrofobowej wnęki znalazła zastosowanie w badaniach nad enzymami i reakcjami enzymatycznymi. Prowadzone były badania nad wykorzystaniem pochodnych cyklodekstryn jako imitatorów enzymów1 oraz jako dodatków do reakcji enzymatycznych2,3. W swojej pracy zbadałem jaki wpływ wywiera obecność zsyntetyzowanej przeze mnie per[2,3,6-tri-O-(2’-metoksy)etylo]-α-cyklodekstryny na aktywność enzymu tryptofanazy katalizującej reakcję hydrolitycznego rozkładu L-tryptofanu do indolu, kwasu pirogronowego oraz amoniaku w obecności fosforanu 5’ –pirydoksalu jako kofaktora. Spodziewałem się że pochodna cyklodekstryny będzie inhibitorem reakcji. Inhibicję odwracalną w reakcjach enzymatycznych można podzielić na kompetycyjną i niekompetycyjną. W pierwszym przypadku inhibitor wiąże się z centrum aktywnym enzymu i w ten sposób współzawodniczy z substratem hamując reakcję. W przypadku inhibitora kompetycyjnego możliwe jest także wiązanie się z substratem. Stopień inhibicji w obecności inhibitora kompetycyjnego zależy od stężenia inhibitora i substratu. Inhibicja niekompetycyjna polega na wiązaniu się inhibitora z wolnym enzymem lub z kompleksem enzym-substrat. Inhibitor niekompetycyjny nie wiąże się z enzymem w miejscu aktywnym i dlatego stopień inhibicji nie zależy od stężenia substratu. Zależy on natomiast od stężenia inhibitora. Reakcje przeprowadziłem dla trzech różnych stężeń per[2,3,6-tri-O-(2’-metoksy)etylo]-α-cyklodekstryny (1, 2 i 3 mM). W każdym przypadku przeprowadziłem 6 reakcji ze zmieniającym się stężeniem substratu (L-tryptofanu). Przed rozpoczęciem eksperymentu substrat inkubowałem z per[2,3,6-tri-O-(2’-metoksy)etylo]-α-cyklodekstryną przez 24 h. Reakcje prowadziłem w środowisku buforu fosforanowego o pH=8. Przebieg reakcji obserwowałem mierząc absorbancję przy pomocy spektrofotometru UV-VIS co 60 sekund w ciągu 20 minut trwania każdej z reakcji. Otrzymane wyniki (zależność szybkości reakcji od stężenia substratu) wykorzystałem do wyznaczenia stałych inhibicji reakcji ( Ki ) w równaniu Michaelisa – Mentena. Identyczne pomiary wykonałem dla reakcji z dodatkiem heksakis-(2,3,6-tri-O-metylo)-α-cyklodekstryny. Przeprowadziłem również pomiary reakcji enzymatycznych L-tryptofanu bez dodatku pochodnych cyklodekstryn oraz wyznaczyłem parametry KM , Vmax . Inhibicja kompetycyjna K’M = KM(1 + [ I ]/Ki) Inhibicja niekompetycyjna V’max = Vmax/(1+ [ I ]/Ki) Synteza Zastosowana przeze mnie metoda syntezy została opisana przez Szejti i współpracowników1. 1.Permetylowane α, β i γ-cyklodekstryny Pierwszym krokiem w syntezie było deprotonowanie wszystkich grup wodorotlenowych przy pomocy wodorku sodu (czterokrotny nadmiar w stosunku do ilość grup OH). Następnym krokiem było wprowadzenie odczynnika elektrofilowego jakim jest jodek metylu (siedmiokrotny nadmiar w stosunku do ilości grup OH). Następnie prowadziłem reakcję przez 24 h w temp. pokojowej. Użytym rozpuszczalnikiem był DMF. Surowy produkt oczyściłem przy pomocy chromatografii kolumnowej. Strukturę otrzymanych związków potwierdziłem przez wykonanie widm 1HNMR, 13CNMR oraz MS. Wydajności reakcji syntezy permetylowanych α, β i γ-cyklodekstryny wyniosła odpowiednio: 81%, 61%, 92%. 2.Per[2,3,6-tri-O-(2’-metoksy)etylo]-α-cyklodekstryna Syntezę wykonałem metodą opisaną w poprzednich reakcjach. W tym wypadku odczynnikiem elektrofilowym był 1-bromo-2-etoksyetan (BrCH2CH2OCH3) Zastosowałem siedmiokrotny nadmiar bromku w stosunku do ilości grup wodorotlenowych. Reakcję prowadziłem przez 48 h w temp. 70°C w DMF. Produkt oczyściłem przy użyciu chromatografii kolumnowej. Strukturę otrzymanych związków potwierdziłem przez wykonanie widm 1HNMR oraz MS. Wydajność wyniosła 86%. Reakcja rozkładu L-tryptofanu do indolu, kwasu pirogronowego i amoniaku katalizowana przez L-tryptofan indol liazę. Wyniki K1i [mM] K2i [mM] KM [mM] Vmax [mM/min] Heksakis-(2,3,6-tri-O-metylo)- α-cyklodekstryna 1,12 7,31 Per[2,3,6-tri-O-(2’-metoksy)etylo]-α-cyklodekstryna 0,24 3,39 L-tryptofan - 3,47x10-1 3,77X102 Wnioski: Z otrzymanych wartości stałych inhibicji wynika, że w przypadku obu związków mamy do czynienia z inhibicją typu mieszanego czyli kompetycyjną oraz niekompetycyjną. Literatura: 1. J. Szejtli, A. Liptak, I. Jodál, P. Fugeti, P. Nánási, A. Neszmélyi, Starch – Stärke 32, No. 5, , 1980. 2. R. Breslow, S.D. Dong, Chem. Rev. 1998, 98, 3. A. Ghanem, V. Schurig, Tetrahedron: Asymmetry 12, 2001, 4. T. Gubica, E. Boroda, A. Temeriusz, M. Kańska, J. Incl. Phenom. Macrocycl. Chem. 2006, 54, K1i – stała inhibicji kompetycyjnej K2i – stała inhibicji niekompetycyjnej KM – stała Michaelisa Vmax – prędkość maksymalna reakcji bez inhibitora V’max – prędkość maksymalna reakcji z inhibitorem [ I ] – stężenie inhibitora
![Wpływ per[2,3,6-tri-O-(2’-metoksy)etylo]-α-cyklodekstryny na katalityczną aktywność L-tryptofan indol liazy](http://slideplayer.pl/slide/418507/1/images/1/Wp%C5%82yw+per%5B2%2C3%2C6-tri-O-%282%E2%80%99-metoksy%29etylo%5D-%CE%B1-cyklodekstryny+na+katalityczn%C4%85+aktywno%C5%9B%C4%87+L-tryptofan+indol+liazy.jpg "Praca magisterska wykonana w Pracowni Węglowodanów, Wydział Chemii, Uniwersytet Warszawski Maciej Rackiewicz Promotor: prof. dr hab. Andrzej Temeriusz Opiekun: mgr Tomasz Gubica. Cele pracy: 1. Synteza i oczyszczenie czterech związków: - Heksakis-(2,3,6-tri-O-metylo)-α-cyklodekstryna. - Heptakis-(2,3,6-tri-O-metylo)-β-cyklodekstryna. - Oktakis-(2,3,6-tri-O-metylo)-γ-cyklodekstryna. - Per[2,3,6-tri-O-(2’-metoksy)etylo]-α-cyklodekstryna. 2.Zbadanie wpływu jaki wywiera dodatek otrzymanych związków na aktywność enzymu L-tryptofan indol liazy w reakcjach enzymatycznych. Wstęp. Cyklodekstryny są to cykliczne oligosacharydy zawierające 6, 7 lub 8 jednostek α-1,4-D-glukopiranozowych nazwane odpowiednio α, β i γ-cyklodekstrynami. Cyklodekstryny zostały odkryte i wyizolowane przez Villiersa w 1891 roku w reakcji degradacji skrobi. Cząsteczka cyklodekstryny ma kształt ściętego stożka o otwartych obu końcach gdzie drugorzędowe grupy hydroksylowe przy C-2 i C-3 zorientowane są przy grubszym końcu stożka natomiast pierwszorzędowe grupy hydroksylowe (C-6) przy cieńszym końcu. Wnętrze cząsteczki jest hydrofobowe natomiast powierzchnia zewnętrzna jest hydrofilowa dzięki czemu cyklodekstryny mają zdolność kompleksowania związków organicznych w swojej wnęce. Właściwości te zainspirowały wielu naukowców do badań nad wykorzystaniem tych związków w wielu dziedzinach chemii. Schematy reakcji: Badania enzymatyczne: Charakterystyczna zdolność cyklodekstryn do inkludowania wielu związków organicznych wewnątrz hydrofobowej wnęki znalazła zastosowanie w badaniach nad enzymami i reakcjami enzymatycznymi. Prowadzone były badania nad wykorzystaniem pochodnych cyklodekstryn jako imitatorów enzymów1 oraz jako dodatków do reakcji enzymatycznych2,3. W swojej pracy zbadałem jaki wpływ wywiera obecność zsyntetyzowanej przeze mnie per[2,3,6-tri-O-(2’-metoksy)etylo]-α-cyklodekstryny na aktywność enzymu tryptofanazy katalizującej reakcję hydrolitycznego rozkładu L-tryptofanu do indolu, kwasu pirogronowego oraz amoniaku w obecności fosforanu 5’ –pirydoksalu jako kofaktora. Spodziewałem się że pochodna cyklodekstryny będzie inhibitorem reakcji. Inhibicję odwracalną w reakcjach enzymatycznych można podzielić na kompetycyjną i niekompetycyjną. W pierwszym przypadku inhibitor wiąże się z centrum aktywnym enzymu i w ten sposób współzawodniczy z substratem hamując reakcję. W przypadku inhibitora kompetycyjnego możliwe jest także wiązanie się z substratem. Stopień inhibicji w obecności inhibitora kompetycyjnego zależy od stężenia inhibitora i substratu. Inhibicja niekompetycyjna polega na wiązaniu się inhibitora z wolnym enzymem lub z kompleksem enzym-substrat. Inhibitor niekompetycyjny nie wiąże się z enzymem w miejscu aktywnym i dlatego stopień inhibicji nie zależy od stężenia substratu. Zależy on natomiast od stężenia inhibitora. Reakcje przeprowadziłem dla trzech różnych stężeń per[2,3,6-tri-O-(2’-metoksy)etylo]-α-cyklodekstryny (1, 2 i 3 mM). W każdym przypadku przeprowadziłem 6 reakcji ze zmieniającym się stężeniem substratu (L-tryptofanu). Przed rozpoczęciem eksperymentu substrat inkubowałem z per[2,3,6-tri-O-(2’-metoksy)etylo]-α-cyklodekstryną przez 24 h. Reakcje prowadziłem w środowisku buforu fosforanowego o pH=8. Przebieg reakcji obserwowałem mierząc absorbancję przy pomocy spektrofotometru UV-VIS co 60 sekund w ciągu 20 minut trwania każdej z reakcji. Otrzymane wyniki (zależność szybkości reakcji od stężenia substratu) wykorzystałem do wyznaczenia stałych inhibicji reakcji ( Ki ) w równaniu Michaelisa – Mentena. Identyczne pomiary wykonałem dla reakcji z dodatkiem heksakis-(2,3,6-tri-O-metylo)-α-cyklodekstryny. Przeprowadziłem również pomiary reakcji enzymatycznych L-tryptofanu bez dodatku pochodnych cyklodekstryn oraz wyznaczyłem parametry KM , Vmax . Inhibicja kompetycyjna K’M = KM(1 + [ I ]/Ki) Inhibicja niekompetycyjna V’max = Vmax/(1+ [ I ]/Ki) Synteza. Zastosowana przeze mnie metoda syntezy została opisana przez Szejti i współpracowników1. 1.Permetylowane α, β i γ-cyklodekstryny. Pierwszym krokiem w syntezie było deprotonowanie wszystkich grup wodorotlenowych przy pomocy wodorku sodu (czterokrotny nadmiar w stosunku do ilość grup OH). Następnym krokiem było wprowadzenie odczynnika elektrofilowego jakim jest jodek metylu (siedmiokrotny nadmiar w stosunku do ilości grup OH). Następnie prowadziłem reakcję przez 24 h w temp. pokojowej. Użytym rozpuszczalnikiem był DMF. Surowy produkt oczyściłem przy pomocy chromatografii kolumnowej. Strukturę otrzymanych związków potwierdziłem przez wykonanie widm 1HNMR, 13CNMR oraz MS. Wydajności reakcji syntezy permetylowanych α, β i γ-cyklodekstryny wyniosła odpowiednio: 81%, 61%, 92%. 2.Per[2,3,6-tri-O-(2’-metoksy)etylo]-α-cyklodekstryna. Syntezę wykonałem metodą opisaną w poprzednich reakcjach. W tym wypadku odczynnikiem elektrofilowym był 1-bromo-2-etoksyetan (BrCH2CH2OCH3) Zastosowałem siedmiokrotny nadmiar bromku w stosunku do ilości grup wodorotlenowych. Reakcję prowadziłem przez 48 h w temp. 70°C w DMF. Produkt oczyściłem przy użyciu chromatografii kolumnowej. Strukturę otrzymanych związków potwierdziłem przez wykonanie widm 1HNMR oraz MS. Wydajność wyniosła 86%. Reakcja rozkładu L-tryptofanu do indolu, kwasu pirogronowego i amoniaku katalizowana przez L-tryptofan indol liazę. Wyniki. K1i [mM] K2i [mM] KM [mM] Vmax [mM/min] Heksakis-(2,3,6-tri-O-metylo)- α-cyklodekstryna. 1,12. 7,31. Per[2,3,6-tri-O-(2’-metoksy)etylo]-α-cyklodekstryna. 0,24. 3,39. L-tryptofan. - 3,47x ,77X102. Wnioski: Z otrzymanych wartości stałych inhibicji wynika, że w przypadku obu związków mamy do czynienia z inhibicją typu mieszanego czyli kompetycyjną oraz niekompetycyjną. Literatura: 1. J. Szejtli, A. Liptak, I. Jodál, P. Fugeti, P. Nánási, A. Neszmélyi, Starch – Stärke 32, No. 5, , R. Breslow, S.D. Dong, Chem. Rev. 1998, 98, A. Ghanem, V. Schurig, Tetrahedron: Asymmetry 12, 2001, T. Gubica, E. Boroda, A. Temeriusz, M. Kańska, J. Incl. Phenom. Macrocycl. Chem. 2006, 54, K1i – stała inhibicji kompetycyjnej. K2i – stała inhibicji niekompetycyjnej. KM – stała Michaelisa. Vmax – prędkość maksymalna reakcji bez inhibitora. V’max – prędkość maksymalna reakcji z inhibitorem. [ I ] – stężenie inhibitora.")
Podobne prezentacje
