Dr. K. Luden Dopuszczanie i stosowanie alternatywnych metod w analizach mikrobiologicznych Dr Katrin Luden Warschau Nov. 2008 1

Dyrektywa ws. wody do spożycia 98/83/EC Dr. K. Luden Dyrektywa ws. wody do spożycia 98/83/EC Artykuł 7 Monitoring 5(b) metody inne niż określone w załączniku III część 1 mogą być wykorzystywane pod warunkiem, że można wskazać, iż uzyskane wyniki są co najmniej tak wiarygodne, jak te uzyskane z wykorzystaniem określonych metod. (Metody mikrobiologiczne) Państwa Członkowskie, które wykorzystały metody alternatywne dostarczają Komisji wszelkich stosownych informacji dotyczących takich metod oraz ich równoważności. Warschau Nov. 2008 2

Proces dopuszczania (Niemcy) Dr. K. Luden Proces dopuszczania (Niemcy) Niemiecka ustawa o wodzie do spożycia: za ocenę metod alternatywnych odpowiedzialna jest Federalna Agencja Środowiska Procedura wniosku o dopuszczenie: Wniosek musi być złożony do Agencji Porównania dokonuje się stosując ISO 17994 (2004) Kryteria ustalania równoważności pomiędzy metodami mikrobiologicznymi Metoda musi zostać opublikowana w wykazie metod alternatywnych przez Agencję Warschau Nov. 2008 3

Warunki wstępne Wyniki pomiarów muszą być: Obiektywnie właściwe Dr. K. Luden Warunki wstępne Wyniki pomiarów muszą być: Obiektywnie właściwe Powtarzalne Możliwe do oceny / ewaluacji Niestety nie do końca zgodne w odniesieniu do parametrów mikrobiologicznych określonych metodami konwencjonalnymi Warschau Nov. 2008 4

Alternatywne metody stosowane w Niemczech Dr. K. Luden Alternatywne metody stosowane w Niemczech Parametr E. coli Enterococci Liczba kolonii Metoda referencyjna ISO 9308-1 ISO 7899-2 ISO 6222 Metoda alternatywna Colilert®-18 Chromocult Enterokokken-Agar Niemiecka ustawa o wodzie do spoż. z 1990 r. Warschau Nov. 2008 5

Czym są coliformy? Metabolizm laktozy / tworzenie gazu „historycznie” Dr. K. Luden Czym są coliformy? Metabolizm laktozy / tworzenie gazu „historycznie” Warschau Nov. 2008 6

ISO 9308-1 (metoda referencyjna) Dr. K. Luden ISO 9308-1 (metoda referencyjna) Wykrywanie: metabolity i działanie enzymów Coliformy : - przekształcanie laktozy w kwas - negatywny wynik testu na wykrywanie oksydazy E. coli: - wytwarzanie indolu w 44°C Klebsiella pneumoniae Serratia marcescens Czas trwania: ok. 48 lub więcej dla uzyskania wyników pozytywnych Warschau Nov. 2008 7

Czym są coliformy? ISO 9308-1 Metabolizm laktozy / tworzenie gazu Dr. K. Luden Czym są coliformy? Metabolizm laktozy ISO 9308-1 Metabolizm laktozy / tworzenie gazu „historycznie” Warschau Nov. 2008 8

Colilert®-18 Wykrywanie działania specyficznych enzymów Coliformy: Dr. K. Luden Colilert®-18 Wykrywanie działania specyficznych enzymów Coliformy: β-Galaktozydaza Laktoza + H2O → Glukoza + Galaktoza E. coli: Dodatkowo β-Glukuronidaza Czas trwania: 18 godzin Warschau Nov. 2008 9

β-Galaktozydaza Colilert®-18 Dr. K. Luden Czym są coliformy? β-Galaktozydaza Colilert®-18 Metabolizm laktozy ISO 9308-1 Metabolizm laktozy / tworzenie gazu „historycznie” Warschau Nov. 2008 10

Czym są coliformy? “historycznie” ISO 9308-1 Colilert®-18 Escherichia Dr. K. Luden Czym są coliformy? “historycznie” ISO 9308-1 Colilert®-18 Escherichia Klebsiella Enterobacter Citrobacter Yersinia Serratia Hafnia Pantoea Kluyvera Cedecea Ewingella Moellerella Leclercia Rahnella Yokenella Coliformy środowiskowe i fekalne Kreig, 1984; Topley, 1997; Ewing, 1986; Ballows,1992 Warschau Nov. 2008 11

Problemy Zasady testów nie są identyczne Dr. K. Luden Problemy Zasady testów nie są identyczne do oceny równoważności przyjmuje się średnią wyników (statystyka) Coliformy wykrywane jedną metodą według innej nie są coliformami Co zrobić z różnymi wynikami uzyskanymi dwoma „równoważnymi” metodami, np. w przypadku badania prób przez różne laboratoria? Niezależnie od metody wykrywania coliformów, wyniki nie spełniają wymogów dyrektywy (limit: 0 CFU/100 ml) Warschau Nov. 2008 12

Enterococci Metody bardzo podobne, ale stosuje się różne substarty Dr. K. Luden Enterococci ISO 7899-2 Chromocult®- Enterococci agar Filtracja membranowa Podłoże selektywne (NaN3) + TTC Czerwone kolonie po 2 dniach Potwierdzenie na drugim podłożu Łączny czas: ok. 48 h Podłoże selektywne + Salmon-Glukosid (ß-D-Glukozydaza) Czerwone kolonie po 24 godzinach Metody bardzo podobne, ale stosuje się różne substarty Stosując metodę alternatywną można uzyskać wyższe wyniki w krótszym czasie… Warschau Nov. 2008 13

Liczba kolonii “stara ustawa” Limit 100 CFU/ml Dr. K. Luden Liczba kolonii Test tradycyjnie stosowany w Niemczech w monitoringu kontrolnym “stara ustawa” Limit 100 CFU/ml ISO 6222 Brak nieprawidłowych zmian Podłoże i inkubacja przez 2 dni 20°C i 36°C inkubacja do 3 dni 22°C i 36°C W tych „równoważnych” metodach stosuje się: Inne substraty Inny czas Inne temperatury Warschau Nov. 2008 14

Dr. K. Luden Wnioski Pamiętaj! Nawet jeżeli równoważność wykazano w badaniach porównawczych stosując ISO 17994, metody mogą dawać całkowicie odmienne wyniki, jeżeli zastosuje się je w stosunku do tego samego rzeczywistego przypadku Publiczne służby zdrowia stają w obliczu poważnych problemów związanych z tymi różnicami w wynikach. Warschau Nov. 2008 15

Dziękuję Państwu za uwagę! Dr. K. Luden Dziękuję Państwu za uwagę! Warschau Nov. 2008 16