Dr. K. Luden Zapewnianie jakości pracy laboratorium przez badania międzylaboratoryjne Badanie biegłości Dr Katrin Luden Warschau Nov. 2008 1.

Prezentacja na temat: "Dr. K. Luden Zapewnianie jakości pracy laboratorium przez badania międzylaboratoryjne Badanie biegłości Dr Katrin Luden Warschau Nov. 2008 1."— Zapis prezentacji:

1 Dr. K. Luden Zapewnianie jakości pracy laboratorium przez badania międzylaboratoryjne Badanie biegłości Dr Katrin Luden Warschau Nov

2 Dyrektywa w sprawie wody do spożycia 98/83/WE
Dr. K. Luden Dyrektywa w sprawie wody do spożycia 98/83/WE Załącznik III Specyfikacja dla analizy parametrów Każde Państwo Członkowskie musi zapewnić, że każde laboratorium, w którym analizowane są próbki, posiada system kontroli jakości analiz, podlegający okresowemu sprawdzaniu przez osobę niepodlegającą danemu laboratorium i zatwierdzoną przez odpowiednie władze do tego celu. Warschau Nov

3 Niemiecka ustawa o wodzie do spożycia
Dr. K. Luden Niemiecka ustawa o wodzie do spożycia § 15 Metody analityczne i laboratoria (4) Wymagane analizy, w tym pobieranie prób, przeprowadzane będą przez laboratoria pracujące zgodnie z „powszechnie akceptowanymi zasadami techniki” (allgemein anerkannte Regeln der Technik), posiadające wewnętrzny system kontroli jakości, uczestniczące przynajmniej raz do roku w zewnętrznych programach zapewniania jakości, dysponujące personelem o odpowiednich kwalifikacjach i akredytowane przez powszechnie uznaną jednostkę akredytacyjną. Odpowiedzialny najwyższy organ federalny opublikuje listę laboratoriów jemu podległych. (5) Władze (federalne) niezależne od laboratoriów sprawdzać będą regularnie, czy warunki określone w punkcie (4) zostały spełnione. Warschau Nov

4 Dr. K. Luden Badanie biegłości Uczestnictwo w programach badania biegłości pozwala laboratoriom: Identyfikować obszary, w których potrzebna jest poprawa wykonywania badań i pomiarów Identyfikować potrzeby szkoleniowe personelu Potwierdzić ufność w przeprowadzane badania i pomiary Potwierdzić zdolność laboratorium do przeprowadzania akredytowanych badań i kalibracji Warschau Nov

5 Dżungla standardów dot. BB / ZZJ
Dr. K. Luden Dżungla standardów dot. BB / ZZJ Istnieje kilka standardów i wytycznych opisujących programy BB / EQA (w kolejności chronologicznej • Przewodnik ISO/IEC 43-1:1996 Badanie biegłości w formie międzylaboratoryjnych badań porównawczych – Część 1: Opracowywanie i obsługa programów badania biegłości • ISO 13528:2005 Metody statystyczne wykorzystywane w badaniu biegłości w formie międzylaboratoryjnych badaniach porównawczych • Raport techniczny IUPAC 1/2006 Międzynarodowy zharmonizowany protokół badania biegłości chemicznych laboratoriów analitycznych • ILAC-G13:2007 Wytyczne ILAC w sprawie kompetencji dostawców programów badania biegłości • ISO/TS Jakość wody – międzylaboratoryjne badania porównawcze do badania biegłości chemicznych laboratoriów analitycznych • ISO/IEC CD 17043:2008 Ocena zgodności – ogólne wymogi badań biegłości Warschau Nov

6 Zapewnianie Jakości przez jednostki zewnętrzne (ZZJ)
Dr. K. Luden Zapewnianie Jakości przez jednostki zewnętrzne (ZZJ) Rekomendacja Federalnej Agencji Środowiska Mikrobiologia Warschau Nov

7 Zapewnianie Jakości przez jednostki zewnętrzne (ZZJ)
Dr. K. Luden Zapewnianie Jakości przez jednostki zewnętrzne (ZZJ) Rekomendacja Federalnej Agencji Środowiska Mikrobiologia Parametr zakończony pozytywnym wynikiem udział w programach badania biegłości E. coli/Coliformy Enterococci Liczebność kolonii 2x / rok Clostridium perfringens Legionella Pseudomonas aeruginosa 1x / rok Wirusy enteropatogenne Cryptosporidium parvum Międzynarodowe BB Warschau Nov

8 Zapewnianie Jakości przez jednostki zewnętrzne (ZZJ)
Dr. K. Luden Zapewnianie Jakości przez jednostki zewnętrzne (ZZJ) Rekomendacja Federalnej Agencji Środowiska Chemia Parametr zakończony pozytywnym wynikiem udział w programach badania biegłości Wszystkie parametry badane przez laboratorium 1x na 2-3 lata Badanie biegłości (BB) według DIN Warschau Nov

9 Jednostki organizujące badania biegłości w Niemczech
Dr. K. Luden Jednostki organizujące badania biegłości w Niemczech Mikrobiologia i chemia w ochronie zdrowia Chemia Regularne spotkania, zharmonizowane terminy, identyczna ocena statystyczna → porównywalność dla laboratoriów i władz Warschau Nov

10 DIN 38402-45 Norma może być zastosowana, jeżeli:
Dr. K. Luden DIN Norma może być zastosowana, jeżeli: Analizowany parametr może zostać uznany za mierzalny w trybie ciągłym prawda w przypadku większości parametrów chemicznych i fizyko-chemicznych nie zawsze prawda w przypadku parametrów biologicznych i/lub mikrobiologicznych Zastosowanie w chemii: tak Zastosowanie w mikrobiologii: w drodze prób / w większości przypadków Warschau Nov

11 Dr. K. Luden BB mikrobiologia Państwowy Instytut Zdrowia Publicznego Dolnej Saksonii (NLGA) świadczy usługi w zakresie badań biegłości (BB) w dziedzinie pomiarów mikrobiologicznych w wodzie do spożycia w Niemczech Co roku: 4 BB w obszarze E. coli / coliformy, Enterococci i liczebność kolonii 2 BB w obszarze Pseudomonas aeruginosa, Clostridium perfringens i Legionella 1 BB w obszarze stanu wody w kąpieliskach wg przepisów UE (E. coli, coliformy) 1 BB w obszarze wybranych parametrów „higieniczno – chemicznych” Warschau Nov

12 BB mikrobiologia Parametr Metody 1986 -1999 2000 2001 2002 2003 2004
Dr. K. Luden BB mikrobiologia Parametr Metody 2000 2001 2002 2003 2004 2006 2007 2008 E. coli – coliformy Test na obecność DIN EN ISO Colilert®-18/Quanti-Tray® + (+) Liczebność kolonii Niemiecka ustawa DWD 1990 DIN EN ISO 6222 Enterococci EN ISO Chromocult®-Enterococci-Agar Clostridium perfringens DWD (mCP-Agar) TSC Pseudomonas aeruginosa EN 12780/ISO 16266 Legionella spec. GVPC (ISO ) Dyrektywa UE ws. wody w kąpieliskach Coliformy fekalne DIN EN ISO Enterococci jelitowe DIN EN ISO DIN EN ISO Warschau Nov

13 BB mikrobiologia Parametr Metody 1986 -1999 2000 2001 2002 2003 2004
Dr. K. Luden BB mikrobiologia Parametr Metody 2000 2001 2002 2003 2004 2006 2007 2008 E. coli - coliformy Test na obecność DIN EN ISO Colilert®-18/Quanti-Tray® + (+) Liczebność kolonii Niemiecka ustawa DWD 1990 DIN EN ISO 6222 Enterococci EN ISO Chromocult®-Enterococci-Agar Clostridium perfringens DWD (mCP-Agar) TSC Pseudomonas aeruginosa EN 12780/ISO 16266 Legionella spec. GVPC (ISO ) Dyrektywa UE ws. wody w kąpieliskach Coliformy fekalne DIN EN ISO Enterococci jelitowe DIN EN ISO DIN EN ISO Warschau Nov

14 Materiał liofilizowany
Dr. K. Luden Próby do BB – dwie opcje Próby płynne Materiał liofilizowany Roztwór bakterii na określonym podłożu mineralnym Bakterie adsorbowane na mleku w proszku Próby bardzo realistyczne Postępowanie dokładnie takie, jak w przypadku prawdziwej próby Należy przygotować roztwór i pierwszy krok postępowania jest inny, niż w przypadku prawdziwej próby Stabilność 4 – 6 dni od wysyłki w <10°C Stabilność w temp. -20°C przez kilka tygodni lub miesięcy Niemcy Wielka Brytania, Francja, Szwecja, Australia... Warschau Nov

15 Dr. K. Luden Przygotowanie w NLGA Warschau Nov

16 Wysyłka 300 - 500 uczestników BB Zarejestrowano:
Dr. K. Luden Wysyłka uczestników BB Zarejestrowano: > 700 Laboratoriów z Niemiec Austrii (26) Szwajcarii (8) Litwy (2) Węgier(2) Wielkiej Bryt. (1) Luksemburga (1) Warschau Nov

17 Terminarz programu badań biegłości
Dr. K. Luden Terminarz programu badań biegłości Rejestracja uczestników Potwierdzenie rejestracji (4 tygodnie przed BB) Przygotowanie i wysyłka prób Wewnętrzna kontrola jakości (dwa tygodnie przed i 6 dni po wysyłce) Raport nt. wyników (w ciągu 16 dni od wysyłki) Ocena wyników zazwyczaj w ciągu 4 tygodni po terminie składania raportów Warschau Nov

18 Co dostają laboratoria?
Dr. K. Luden Co dostają laboratoria? Raport na temat opracowania BB, wyjątkowych problemów, interesujących wyników, etc. Świadectwo i raport z oceny Karty kontroli jakości opisujące wpływ temperatury i czasu trwania transportu Z(u)-Wyniki wszystkich pomiarów ujętych w tabeli Z(u)-Wyniki w formie graficznej Warschau Nov

19 Dr. K. Luden Statystyka DIN Statystyka odpornościowa (bez badania elementów odstających); średnia konsensusu (wykorzystana jako wartość przypisana) obliczona przy pomocy Estymatora Hampela Wartości ZU „normalizują” wyniki porównania różnych poziomów stężenia bakterii Wartości Z: lZUl  2 - wystarczająca lZUl  3 - wątpliwa lZUl > 3 - niewystarczająca m-4,5s m-3s m-1,5s m m+1,5s m+3s m+4,5s Warschau Nov

20 Świadectwo Nazwa / adres organizatora BB Adres uczestnika
Dr. K. Luden Świadectwo Nazwa / adres organizatora BB Adres uczestnika Nr identyfikacyjny BB (np ) Tabela parametrów, parametrów oznaczonych prawidłowo oraz użytych metod Podpis organizatora BB Warschau Nov

21 Grupa B III-2008 E. coli (wartość przypisana 21 CFU/100 ml)
Dr. K. Luden BB mikrobiologia ZU-score Labcode Warschau Nov

22 Międzylaboratoryjne badania porównawcze
Dr. K. Luden Międzylaboratoryjne badania porównawcze badania walidacyjne metody: podstawą jest chęć uczestnictwa/kwalifikacje laboratorium materiał referencyjny zgodny z przeznaczeniem w celu certyfikacji materiału referencyjnego: metoda musi być właściwie dobrana do celu/zwalidowana laboratoria eksperckie kontrola jakości / badanie biegłości: testowany jest sposób działania laboratorium, materiał referencyjny i metoda muszą być zwalidowane / zgodne z przeznaczeniem Warschau Nov

23 E. coli BB 1-2003 Dr. K. Luden Warschau Nov. 2008 23 5 10 15 20 25 30
5 10 15 20 25 30 35 40 45 R 428 3 183 12 162 406 445 543 178 56 340 437 459 219 328 442 469 284 367 460 116 279 149 545 522 391 60 386 36 Labcode E. coli CFU / 100 ml E. coli / 100 ml X-3s X-2s X X+2s X+3s Warschau Nov

24 Clostridium perfringens
Dr. K. Luden Clostridium perfringens PT CFU/100 ml Labcode Warschau Nov

25 Clostridium perfringens Podłoże / zastosowana metoda
Dr. K. Luden Clostridium perfringens Podłoże / zastosowana metoda Stopień odzysku Agar Columbia z krwią / filtracja membranowa 100 % Columbia blood agar / membrane filtration - no shaking of the sample 39 % DEV-Nutrient agar / pour plate method 78 % mCP Agar / Filtration (24 hours TNT) 43 % mCP Agar / Filtration (24 hours 4°C) Agar mCP / filtracja (średnia uczestników BB) 11 % Warschau Nov

26 Clostridium perfringens Podłoże / zastosowana metoda
Dr. K. Luden Clostridium perfringens Podłoże / zastosowana metoda Stopień odzysku Agar Columbia z krwią / filtracja membranowa 100 % Agar Columbia z krwią / filtracja membranowa – bez wstrząsania próby 39 % DEV-Nutrient agar / metoda płytek lanych 78 % mCP Agar / Filtracja (24 godz. TNT) 43 % mCP Agar / Filtracja (24 godz. 4°C) mCP Agar / Filtracja (średnia uczestników BB) 11 % Warschau Nov

27 Dr. K. Luden Warschau Nov

28 Pseudomonas aeruginosa
Dr. K. Luden Pseudomonas aeruginosa W BB % laboratoriów oblało test, ponieważ podały numeryczne wyniki dla P. aeruginosa, podczas gdy przesłany szczep nie był szczepem P. aeruginosa Prawdopodobne wyjaśnienie: problemy z reakcją potwierdzającą – wydzielaniem amoniaku z acetamidu E. coli P. species P. putida Kontrola negat. P. aeruginosa Warschau Nov

29 E. coli W BB 4-2004 wykorzystano czystą kulturę E. coli
Dr. K. Luden E. coli W BB wykorzystano czystą kulturę E. coli Fałszywe wyniki: ISO : 2,4 % Colilert®-18: 18,8 % Colilert (n = 80) E. coli Coliformy delta 66 70 4 62 8 74 78 83 9 30 43 13 48 50 2 53 5 3 59 6 19 21 24 25 1 27 45 18 ISO (n = 246) E. coli Coliformy delta 61 68 7 25 30 54 24 15 16 1 21 22 Warschau Nov

30 Wyjaśnienie? ß-Galactosidase ß-Glucuronidase Dr. K. Luden
Warschau Nov

31 Dr. K. Luden Wnioski Interakcja pomiędzy filtrem, a pożywką agarową może być niekorzystna dla wzrostu organizmu docelowego Należy sprawdzić działanie kombinacji stosowanych materiałów (nawet, jeżeli dostarczane są z odpowiednim certyfikatem) Kontrole negatywne są tak samo ważne, jak pozytywne Badając sprawność laboratorium można dowiedzieć się nowych rzeczy na temat metod .... Warschau Nov

32 Dr. K. Luden Dziękuję za uwagę! Warschau Nov

33 Najbardziej prawdopodobne błędy - E. coli / coliformy
Dr. K. Luden Najbardziej prawdopodobne błędy - E. coli / coliformy Formalne błędy w wynikach: E. coli zalicza się do grupy coliformów, dlatego liczba E. coli nie może być większa, niż łączna liczba coliformów Komercyjne systemy identyfikacji (które nie powinny być używane podczas BB) mogą dawać sprzeczne wyniki z metodą użytą w BB ISO : 44°C wydzielanie indolu, nieprawidłowa lub niewystarczająco precyzyjnie kontrolowana temperatura inkubacji (należy korzystać z kąpieli wodnej) Colilert®-18: pomiary przeprowadzone z zastosowaniem złej długości fali; otwory nie wypełnione prawidłowo. Warschau Nov

34 Najbardziej prawdopodobne błędy przy liczeniu kolonii
Dr. K. Luden Najbardziej prawdopodobne błędy przy liczeniu kolonii Zanieczyszczenie stopionego agaru lub próby Zbyt wysoka temperatura agaru: niewielki wzrost temperatury spowodować może znaczący spadek liczby bakterii zdolnych tworzyć kolonie; zbyt niska temperatura prowadzić może do nierównomiernego rozłożenia bakterii, ponieważ agar się zbryla, co uniemożliwia właściwe mieszanie Zbyt mała ilość agaru Warschau Nov