Pobieranie prezentacji. Proszę czekać

Pobieranie prezentacji. Proszę czekać

I nstrumentalne M etody B adania S truktury i A ktywności B iomolekuł (IMBSiAB) podsumowanie laboratorium prof. M. Kamiński GDAŃSK 2013.

Podobne prezentacje


Prezentacja na temat: "I nstrumentalne M etody B adania S truktury i A ktywności B iomolekuł (IMBSiAB) podsumowanie laboratorium prof. M. Kamiński GDAŃSK 2013."— Zapis prezentacji:

1 I nstrumentalne M etody B adania S truktury i A ktywności B iomolekuł (IMBSiAB) podsumowanie laboratorium prof. M. Kamiński GDAŃSK 2013

2 Cel ćwiczenia - zasadniczy P Poznanie w praktyce metodologii / metodyk postępowania dla doboru optymalnego układu rozdzielczego typu HPLC do rozdzielania peptydów / białek i otrzymania frakcji w celu dokonania, następnie, badań struktury molekularnej, właściwości użytkowych itp. na przykładzie rozdzielania składników supernatantu hodowli bakteryjnej dla wydzielenia aktywnej formy naturalnych antybiotyków peptydowych (bakteriocyn) – stafylokokcyn - St T, lub St C.

3 Cele dodatkowe Poznanie alternatywnych układów LC, umożliwiających osiągnięcie celu zasadniczego – izolacji aktywnej formy naturalnego antybiotyku peptydowego; Poznanie zasad i sposobów określania (wyznaczania / obliczania) oraz doboru (projektowania) optymalnych wartości parametrów operacyjnych dla wybranych alternatywnych układów rozdzielczych, potencjalnie umożliwiających osiągnięcie celu zasadniczego; Zespołowe rozwiązywanie problemów oraz zespołowa praca nad przygotowaniem raportu z badań Poznanie techniki LC/HPLC i najważniejszych problemów, które mogą mieć miejsce

4 Zasada realizacji ćwiczenia oraz przygotowania sprawozdania – raportu z badań Praca eksperymentalna w podgrupach Zespołowe opracowanie wyników przez podgrupy przygotowanie części sprawozdania / raportu z badań podgrupy, wraz z wynikami obliczeń najważniejszych parametrów operacyjnych i wnioskami, wynikającymi z badań podgrupy Zespołowe opracowanie sprawozdania całej grupy oraz opracowanie zależności / wniosków dodatkowych tzn., części spinającej badania w podgrupach, ew. obliczenie / wyznaczenie dodatkowych parametrów / zależności funkcyjnych możliwych do określenia dopiero na podstawie badań poszczególnych podgrup – łącznie oraz sformułowanie dodatkowych wniosków

5 Etapy procedury, skala operacji, układy rozdzielcze, opis warunków i parametry operacyjne rozdzielania Przygotowanie wsadu / pre-rozdzielanie / rozdzielanie właściwe jedno-, najczęściej, wielo-etapowe z zastosowaniem detekcji - jeden, albo kilka detektorów HPLC, połączonych szeregowo lub równolegle / kontrola czystości frakcji (z zastosowaniem analityki instrumentalnej, w tym, HPLC) / kontrola aktywności antybiotycznej), // wydzielanie produktu / doczyszczanie (poza ramami czasowymi ćwiczenia) Skala modelowa / powiększanie skali rozdzielania (poza ramami czasowymi ćwiczenia) GPC / SEC – H (war. hydrofilowe) – rozdzielanie wstępne, odsalanie; RP / HILIC // IExC / IExcl – (jedna z tych odmian chromatografii nieprzydatna dla peptydów i białek – która ?) Parametry operacyjne - rodzaj sorbentu / powierzchnia sorpcyjna (A), wielkość porów (d/ Δd), kształt i wielkość ziaren wypełnienia kolumn/y (dp / Δdp), natężenie przepływu eluentu (w) / liniowa prędkość (u) / średnica (dc), długość kolumny (Lc), stężenie roztworu dozowanego (Cmix) / objętość dozowana (Vi) rozpuszczalnik roztworu dozowanego, korzystnie - w przeliczeniu na jednostkę masy / objętości / powierzchni wypełnienia kolumny // jednostkę przekroju poprzecznego kolumny

6

7 TECHNIKA

8 Przykłady otrzymanych przez Państwa wyników rozdzielania, przebiegu chromatogramów, widm UV-VIS / RID - do opracowania, sformułowania wniosków w sprawozdaniach podgrup / grup laboratoryjnych

9 PRE-rozdzielanie / odsalanie GPC/SEC – H kolumna HPLC – DIOL 100

10 RP-HPLC – elucja gradientowa, detekcja UV-VIS-DAD Możliwość określenia widm / identyfikacji wstępnej na podstawie UV-VIS (proszę zwrócić uwagę na : ewentualność wykluczania, wartość długości fali w maksimum widm, okoliczność absorpcji światła UV przez St-T/St-C do 305 nm / ewentualność wytrącania się składników mieszaniny dozowanej w momencie dozowania do kolumny, zakres zmienności wartości molowych współczynników absorpcji światła składników.

11 Zestawienie chromatogramów różnych wsadów

12 Warunki RP - integrator, zbieranie frakcji; Stosowanie przepływu zwrotnego eluentu w kolumnie; Kolejno - badanie czystości frakcji / aktywności a-biotycznej ; Pik 32,96 min – składniki o wysokiej hydrofobowości pozostałe w kolumnie po elucji St, eluowane w warunkach zwrotnego przepływu eluentu

13 Zestawienie widm UV kilku peptydów

14 Nałożenie chromatogramów rozdzielania w tych samych warunkach - RP, elucja izokratyczna

15 Kolumna Accucore – HILIC – układ ortogonalny względem RP Warunki HILIC, elucja izokratyczna – należy preferować elucję izokratyczną w P-LC / P-HPLC, w przypadku rozdzielania peptydów / białek elucja gradientowa może zapewniać lepszą selektywność rozdzielania

16 Chromatogramy dla kilku różnych długości fali światła UV

17 Nałożenie chromatogramów – dwie różne bakteriocyny – St T i St C – HILIC warunki izokratyczne

18 Oznaczenie czystości frakcji Możliwość stosowania nowoczesnych technik chemii analitycznej, w tym HPLC-UV-VIS/DAD; Identyfikacja na podstawie czqasu retencji, oraz dodatkwo, z zastosowaniem widm UV-VIS dzięki detektorowi DAD; Korzystne stosowanie układów ortogonalnych, np., rozdzielanie – RP / oznaczanie czystości frakcji / produktu – HILIC lub NP..

19

20 Badanie aktywności antybiotycznej Nr krążka Frakcja Strefa zahamowania wzrostu (intensywność +/-,+,++, +++) Dodatkowe informacje 1F VI 11,8-14,41+++ Staf T ACN:H 2 O 3:7 + 0,075% TFA (HP1050) 2F II 3,3-5Brak 3F I 2,15-3,3+ 4F III 5,0-6,1Brak 5F IV 6,1-9,1+/- 6F V 9,1-11,8++ 7F VIII BF 33,7-42,0Brak 8F VII 14,4-17,0Brak 9F 2 2,6-5,8Brak Staf C ACN:H 2 O 3:7 +0,075% TFA (HP1050) 10F 5 12,2-20,0Brak 11F 3 5,8-8,2+/- 12F 4 8,5-11,6++ 13F 1 1,95-2,6Brak 14BF 37,0-45,0Brak 155 1,86-4,44Brak ACN:H 2 O, 2 część frakcji gr. P. Czerniejewska 168 7,52-8,46Brak 171 0,49-0,77Brak 182 0,87-1, ,45-4,64Brak 207 4,65-7,50Brak Płytka #2

21 U góry - widok płytki z rezultatami badania aktywności a–biotycznej frakcji; Obok – zahamowanie sterfy wzrostu kolonii bakteryjnej w świetle przechodzącym Przykłady rezultatów badania aktywności anty-biotycznej – wartości zahamowania strefy wzrostu kolonii bakteryjnej

22 Problem braku korekty opóźnienia transportowego dla programu elucji - w przypadku niniejszego rozdzielania - najpierw brak korekty, potem zbyt stromy program elucji


Pobierz ppt "I nstrumentalne M etody B adania S truktury i A ktywności B iomolekuł (IMBSiAB) podsumowanie laboratorium prof. M. Kamiński GDAŃSK 2013."

Podobne prezentacje


Reklamy Google