Pobieranie prezentacji. Proszę czekać

Pobieranie prezentacji. Proszę czekać

Derywatyzacja enzymatyczna w elektroforezie kapilarnej Pracownia Analizy Przepływowej i Chromatografii Kierownik pracy: prof. dr hab. Marek Trojanowicz.

Podobne prezentacje


Prezentacja na temat: "Derywatyzacja enzymatyczna w elektroforezie kapilarnej Pracownia Analizy Przepływowej i Chromatografii Kierownik pracy: prof. dr hab. Marek Trojanowicz."— Zapis prezentacji:

1 Derywatyzacja enzymatyczna w elektroforezie kapilarnej Pracownia Analizy Przepływowej i Chromatografii Kierownik pracy: prof. dr hab. Marek Trojanowicz Opiekun pracy: dr Ewa Poboży Przedmiotem pracy było opracowanie metody derywatyzacji enzymatycznej w wysokosprawnej elektroforezie kapilarnej z detekcją spektrofotometryczną w celu ilościowego oznaczania substratów oksydaz. Reakcje derywatyzacji enzymatycznej przeprowadzano bezpośrednio w kapilarze, stanowiącej swoisty mikroreaktor zgodnie z opisaną wcześniej w literaturze procedurą EMMA (Electrophoretically Mediated Microanalysis). Stosowano różne sposoby prowadzenia reakcji - metodę ciągłego kontaktu reagentów, jak i metodę przenikających się stref. Wykorzystano układ bienzymatyczny oksydaza – peroksydaza z różnymi markerami detekcji oznaczanego związku. Jako związek modelowy wybrano glukozę w celu jej ilościowego oznaczenia jako substratu reakcji utleniania w obecności oksydazy glukozowej (GOx). Zbadano trzy rodzaje układów pozwalających na uzyskanie sygnału spektrofotometrycznego, przy czym zawsze pierwszą reakcją zachodzącą w układzie była: D-glukoza + O 2 D-glukono-1,5-lakton + H 2 O 2 Następna reakcja enzymatyczna miała na celu umożliwienie spektrofotometrycznej detekcji powstającego nadtlenku wodoru. W tym celu zastosowano drugi enzym, peroksydazę chrzanową (HRP), która katalizuje reakcje utleniania różnych związków za pomocą H 2 O 2. Wykorzystano trzy różne substraty peroksydazy chrzanowej: kwas 2,2-azyno-bis(3-etyleno- tiazolino-6-sulfonowy) (ABTS); dinukleotyd nikotyno-amidoadeninowy w formie zredukowanej (NADH) oraz 1,2,3-trihydroksybenzen (pirogalol). W zależności od właściwości absorpcyjnych powstających produktów, detekcję prowadzono przy różnej długości fali. Sygnał uzyskiwany od powstającego produktu jest proporcjonalny do zawartości D-glukozy w próbce. W warunkach takich możliwe są oznaczenia glukozy w zakresie stężeń od 0,005 do 0,1 mmol/L. D-Glukoza + O 2 D-Glukono-1,5-lakton + H 2 O 2 H 2 O 2 + ABTS (red) H 2 O + ABTS (ox) ABTS (ox) + β-NADHABTS (red) + β-NAD Różne sposoby prowadzenia reakcji enzymatycznej w kapilarze: Metoda ciągłego kontaktu (continous mode) GOx HRP EOF PROD Reakcja u wlotu kapilary (at-inlet reaction) Metoda klasyczna strefa–strefa (classic plug–plug) Ignacy Rzygaliński Metoda przenikających się stref (plug-plug mode) GOx Substrat znajduje się w BGE, zaś enzym wstrzykiwany jest w postaci strefy Substrat w BGE Substrat w BGE ENZ PROD EOF Część eksperymentalną pracy magisterskiej wykonano na przyrządzie do elektroforezy kapilarnej Beckman P/ACE MDQ z matrycowym detektorem diodowym UV-Vis. ENZ SUB Pierwszy wsztrzykiwany jest reagent wolniejszy detekcja = 260 nm = 260 nm D-Glukoza + O 2 D-Glukono-1,5-lakton + H 2 O 2 H 2 O 2 + β-NADHH 2 O + β-NAD GOx GOx HRP HRP detekcja = 260 nm = 260 nm detekcja = 304 nm = 304 nm BGEBGEBGEBGE Przykładowe elektroferogramy zarejestrowane dla różnych stężeń glukozy Metoda ciągłego kontaktu reagentów Metoda klasyczna strefa - strefa Przykładowe elektroferogramy zarejestrowane dla różnych stężeń glukozy Trudności obserwowane np. brak liniowości uzyskiwanego sygnału wynikają z: - reakcji ubocznych utleniania ABTS (red) tlenem - reakcji ubocznych utleniania NADH w obecności HRP zarówno H 2 O 2, jak i tlenem Warunki rozdzielania Kapilara niemodyfikowana : l = 50 / 60 cm; i.d.=75 µm. Napięcie: +30 kV. Temperatura: +35,7 °C. Wstrzykiwanie hydrodynamiczne. Nie udało się uzyskać oczekiwanego sygnału od purpurogaliny. Widoczne jest tylko zgrubienie mogące pochodzić od strefy powstającego produktu. Zastosowanie β-NADH jako bezpośredniego substratu peroksydazy chrzanowej pozwoliło ograniczyć układ do dwóch reakcji. Nie udało się wyeliminować problemów związanych z niepożądanymi reakcjami ubocznymi utleniania β-NADH również tlenem, a nie tylko powstającym w wyniku pierwszej reakcji nadtlenkiem wodoru. Wstrzyknięcie: GOx (75 U/ml) HRP (488 U/ml) ABTS (red) (1 mM) BGE: HEPES (30 mM, pH=7) β-NADH (1mM) GLUKOZA Wstrzyknięcie: GOx (75 U/ml) HRP (488 U/ml) ABTS (red) (1 mM) β-NADH (1 mM) GLUKOZA BGE: HEPES (30 mM pH=7) INKUBACJA Metoda EMMA (Electrophoretically mediated microanalysis) Wprowadzenie β-NADH jako substrat peroksydazy chrzanowej (HRP) ABTS jako substrat peroksydazy chrzanowej (HRP) Pirogalol jako substrat peroksydazy chrzanowej (HRP) pirogalolpurpurogalina Elektroferogramy roztworu wzorcowego mieszaniny pirogalolu i purpurogaliny Elektroferogramy zarejestrowane dla różnych czasów inkubacji u wlotu kapilary Roztwory wzorcowe pirogalolu i purpurogaliny Reakcja u wlotu kapilary pirogalolpurpurogalina 304 nm 214 nm enzymy 3 min 1 min Metoda ciągłego kontaktu reagentów Reakcja u wlotu kapilary Zależność powierzchni piku uzyskiwanego sygnału od czasu inkubacji u wlotu kapilary Optymalizacja czasu inkubacji Zależność powierzchni piku od stężenia glukozy (0,001-0,1 mM) Przykładowe elektroferogramy dla różnych stężeń glukozy (czas inkubacji 3 min) Przykładowe elektroferogramy zarejestrowane dla różnych stężeń glukozy Wnioski Podjęto próbę derywatyzacji enzymatycznej w elektroforetycznych oznaczeniach glukozy z zastosowaniem oksydazy glukozowej i 3 różnych substratów peroksydazy chrzanowej. Dla dwóch z nich - ABTS i ß-NADH - uzyskano sygnały umożliwiające ilościowe oznaczenie glukozy. Zastosowanie pirogalolu nie przyniosło oczekiwanych rezultatów. W przypadku wykorzystania ABTS jako substratu HRP konieczne jest przeprowadzenie dodatkowej reakcji. Zastosowanie ß-NADH jako substratu peroksydazy znacznie uprościło układ, pozwalając tym samym na uzyskanie lepszych wyników. Nie udało się jednak wyeliminować trudności związanych z ubocznymi reakcjami utleniania ß-NADH tlenem. β-NAD


Pobierz ppt "Derywatyzacja enzymatyczna w elektroforezie kapilarnej Pracownia Analizy Przepływowej i Chromatografii Kierownik pracy: prof. dr hab. Marek Trojanowicz."

Podobne prezentacje


Reklamy Google