Pobieranie prezentacji. Proszę czekać

Pobieranie prezentacji. Proszę czekać

Wyznaczenie trójwymiarowej struktury inhibitora proteaz serynowych białka SPI-2 i jego mutantów metodami spektroskopii NMR. Urszula Nowicka Promotor: Prof.

Podobne prezentacje


Prezentacja na temat: "Wyznaczenie trójwymiarowej struktury inhibitora proteaz serynowych białka SPI-2 i jego mutantów metodami spektroskopii NMR. Urszula Nowicka Promotor: Prof."— Zapis prezentacji:

1 Wyznaczenie trójwymiarowej struktury inhibitora proteaz serynowych białka SPI-2 i jego mutantów metodami spektroskopii NMR. Urszula Nowicka Promotor: Prof. dr hab. Wiktor Koźmiński, Uniwersytet Warszawski Opiekun : dr Igor Zhukov, Instytut Biochemii i Biofizyki PAN Rys. 1. Galleria Mellonella. Rys. 2. SPI-2 jako inhibitor typu Kazal. Wiązania dwusiarczkowe zaznaczono kolorem żółtym. Rys. 4. Dwadzieścia struktur o najniższej energii nałożone na siebie. Na brązowo zaznaczono aminokwas znajdujący się w pozycji P1, na żółto zaznaczono mostki dwusiarczkowe. A. Białko SPI-2 z Thr w pozycji P1. B. Białko SPI-2 z Ala w pozycji P1. C. Białko SPI-2 z Tyr w pozycji P1. Rys. 6. Modele kompleksów białka SPI-2 z proteazami serynowymi. Na niebiesko zaznaczono białko SPI-2, na różowo miejsce aktywne białka SPI-2, na turkusowo zaznaczono proteazę, na żółto miejsce oddziaływania, na czerwono aminokwas w pozycji P1 białka SPI-2. A. Model kompleksu białka SPI-2 z Thr w pozycji P1 z subtylizyną. B. Model kompleksu białka SPI-2 z Tyr w pozycji P1 z trypsyną. Rys. 5. Nałożone na siebie łańcuchy główne wszystkich trzech białek, których struktury zostały ustalone. Rys. 3. Widmo NOESY wraz z przypisaniem sekwencyjnym. Inhibitory proteaz serynowych są szeroko rozpowszechnione wśród zwierząt i roślin. Można je podzielić na 11 grup. SPI-2 (silk proteinase inhibitor) jest inhibitorem proteaz serynowych zbudowanym z 36 aminokwasów. Białko to odkryto w nici ćmy Galleria Mellonella[1] gdzie pełni istotną rolę w ochronie nici jedwabiu przed degradacją (Rys. 1). SPI-2 jest jednodomenowym białkiem należącym do rodziny Kazal. Inhibitory typu Kazal charakteryzują się dużą stabilnością struktury zapewnianą przez mostki dwusiarczkowe. W strukturze wyróżnić można elementy struktury drugorzędowej: trzy β-kartki ułożone w sposób antyperiplanarny oraz α-helisę. SPI-2 w przeciwieństwie do innych inhibitorów tej rodziny ma dwa, a nie trzy mostki dwusiarczkowe (Rys. 2). Badania dowodzą, iż SPI-2 wykazuje bardzo wysoką aktywność biologiczną względem proteaz bakteryjnych takich jak subtylizyny, oraz proteaz grzybowych (proteinaza K)[2]. Badane białka zostały otrzymane w układzie Pichia Pastoris, a łańcuchy aminokwasowe został wydłużone o 3 aminokwasy na N-końcu oraz o ogon histydynowy na C-końcu łańcucha. Jak zostało ustalone, różne podstawienia w pozycji P1 prowadzą do zróżnicowania substratowej specyficzności w stosunku do proteaz serynowych. Celem prowadzonych badań jest uzyskanie inhibitora wykazującego dużą aktywność względem proteaz serynowych. Bezpośrednim celem tej pracy było ustalenie struktury białka natywnego z Thr w pozycji P1, oraz dwóch białek zmodyfikowanych, które Thr w pozycji P1 zastąpioną miały przez Ala lub Tyr. Widma zarejestrowane zostały na spektrometrze NMR Varian Unity+ 500. Przypisanie sygnałów zostało przeprowadzone na podstawie dwuwymiarowych widm homokorelacyjnych TOCSY (10ms, 80ms), NOESY (50ms, 200ms) (Rys. 3) oraz heterokorelacyjnych HSQC 1 H- 15 N, 1 H- 13 C, przy naturalnej zawartości 15 N i 13 C. Struktury trzeciorzędowe białek (Rys. 4) obliczone zostały za pomocą programów CYANA[3] i XPLOR[4]. Struktury wszystkich trzech białek cechują się dużym podobieństwem (Rys. 5), i wyróżnić w nich można cechy charakterystyczne dla inhibitorów rodziny Kazal. Otrzymane struktury posłużyły do zbudowania realistycznych modeli kompleksów proteaza-inhibitor (Rys. 6), co pozwoliło na zrozumienie szczegółów mechanizmu ich oddziaływania. Wyniki pracy zostaną wykorzystane w dalszych badaniach nad uzyskaniem nowego typu inhibitorów proteaz serynowych. Literatura: [1] Nirmala X., Kodrik D., Zurovec M., Sehnal F. (2001) Eur. J. Biochem., 268, 2064. [2] Kludkiewicz, B., et al., (2005) Prot. Expr. & Purif., 43, 94. [3] Guntert P., Mumenthaler C., Wuthrich K. (1997) J. Mol. Biol., 273, 283. [4] Schwieters C.D., Kuszewski J.J., Tjandra N., Clore G.M. (2003) J. Magn. Reson., 160, 66 kontakt: blobel@tlen.pl Praca została wykonana w Pracowni Oddziaływań Międzycząsteczkowych Wydziału Chemii UW, oraz w Środowiskowym Laboratorium NMR Instytutu Biochemii i Biofizyki PAN.


Pobierz ppt "Wyznaczenie trójwymiarowej struktury inhibitora proteaz serynowych białka SPI-2 i jego mutantów metodami spektroskopii NMR. Urszula Nowicka Promotor: Prof."

Podobne prezentacje


Reklamy Google