Pobieranie prezentacji. Proszę czekać

Pobieranie prezentacji. Proszę czekać

Wyznaczenie trójwymiarowej struktury inhibitora proteaz serynowych białka SPI-2 i jego mutantów metodami spektroskopii NMR. Urszula Nowicka Promotor: Prof.

Podobne prezentacje


Prezentacja na temat: "Wyznaczenie trójwymiarowej struktury inhibitora proteaz serynowych białka SPI-2 i jego mutantów metodami spektroskopii NMR. Urszula Nowicka Promotor: Prof."— Zapis prezentacji:

1 Wyznaczenie trójwymiarowej struktury inhibitora proteaz serynowych białka SPI-2 i jego mutantów metodami spektroskopii NMR. Urszula Nowicka Promotor: Prof. dr hab. Wiktor Koźmiński, Uniwersytet Warszawski Opiekun : dr Igor Zhukov, Instytut Biochemii i Biofizyki PAN Rys. 1. Galleria Mellonella. Rys. 2. SPI-2 jako inhibitor typu Kazal. Wiązania dwusiarczkowe zaznaczono kolorem żółtym. Rys. 4. Dwadzieścia struktur o najniższej energii nałożone na siebie. Na brązowo zaznaczono aminokwas znajdujący się w pozycji P1, na żółto zaznaczono mostki dwusiarczkowe. A. Białko SPI-2 z Thr w pozycji P1. B. Białko SPI-2 z Ala w pozycji P1. C. Białko SPI-2 z Tyr w pozycji P1. Rys. 6. Modele kompleksów białka SPI-2 z proteazami serynowymi. Na niebiesko zaznaczono białko SPI-2, na różowo miejsce aktywne białka SPI-2, na turkusowo zaznaczono proteazę, na żółto miejsce oddziaływania, na czerwono aminokwas w pozycji P1 białka SPI-2. A. Model kompleksu białka SPI-2 z Thr w pozycji P1 z subtylizyną. B. Model kompleksu białka SPI-2 z Tyr w pozycji P1 z trypsyną. Rys. 5. Nałożone na siebie łańcuchy główne wszystkich trzech białek, których struktury zostały ustalone. Rys. 3. Widmo NOESY wraz z przypisaniem sekwencyjnym. Inhibitory proteaz serynowych są szeroko rozpowszechnione wśród zwierząt i roślin. Można je podzielić na 11 grup. SPI-2 (silk proteinase inhibitor) jest inhibitorem proteaz serynowych zbudowanym z 36 aminokwasów. Białko to odkryto w nici ćmy Galleria Mellonella[1] gdzie pełni istotną rolę w ochronie nici jedwabiu przed degradacją (Rys. 1). SPI-2 jest jednodomenowym białkiem należącym do rodziny Kazal. Inhibitory typu Kazal charakteryzują się dużą stabilnością struktury zapewnianą przez mostki dwusiarczkowe. W strukturze wyróżnić można elementy struktury drugorzędowej: trzy β-kartki ułożone w sposób antyperiplanarny oraz α-helisę. SPI-2 w przeciwieństwie do innych inhibitorów tej rodziny ma dwa, a nie trzy mostki dwusiarczkowe (Rys. 2). Badania dowodzą, iż SPI-2 wykazuje bardzo wysoką aktywność biologiczną względem proteaz bakteryjnych takich jak subtylizyny, oraz proteaz grzybowych (proteinaza K)[2]. Badane białka zostały otrzymane w układzie Pichia Pastoris, a łańcuchy aminokwasowe został wydłużone o 3 aminokwasy na N-końcu oraz o ogon histydynowy na C-końcu łańcucha. Jak zostało ustalone, różne podstawienia w pozycji P1 prowadzą do zróżnicowania substratowej specyficzności w stosunku do proteaz serynowych. Celem prowadzonych badań jest uzyskanie inhibitora wykazującego dużą aktywność względem proteaz serynowych. Bezpośrednim celem tej pracy było ustalenie struktury białka natywnego z Thr w pozycji P1, oraz dwóch białek zmodyfikowanych, które Thr w pozycji P1 zastąpioną miały przez Ala lub Tyr. Widma zarejestrowane zostały na spektrometrze NMR Varian Unity Przypisanie sygnałów zostało przeprowadzone na podstawie dwuwymiarowych widm homokorelacyjnych TOCSY (10ms, 80ms), NOESY (50ms, 200ms) (Rys. 3) oraz heterokorelacyjnych HSQC 1 H- 15 N, 1 H- 13 C, przy naturalnej zawartości 15 N i 13 C. Struktury trzeciorzędowe białek (Rys. 4) obliczone zostały za pomocą programów CYANA[3] i XPLOR[4]. Struktury wszystkich trzech białek cechują się dużym podobieństwem (Rys. 5), i wyróżnić w nich można cechy charakterystyczne dla inhibitorów rodziny Kazal. Otrzymane struktury posłużyły do zbudowania realistycznych modeli kompleksów proteaza-inhibitor (Rys. 6), co pozwoliło na zrozumienie szczegółów mechanizmu ich oddziaływania. Wyniki pracy zostaną wykorzystane w dalszych badaniach nad uzyskaniem nowego typu inhibitorów proteaz serynowych. Literatura: [1] Nirmala X., Kodrik D., Zurovec M., Sehnal F. (2001) Eur. J. Biochem., 268, [2] Kludkiewicz, B., et al., (2005) Prot. Expr. & Purif., 43, 94. [3] Guntert P., Mumenthaler C., Wuthrich K. (1997) J. Mol. Biol., 273, 283. [4] Schwieters C.D., Kuszewski J.J., Tjandra N., Clore G.M. (2003) J. Magn. Reson., 160, 66 kontakt: Praca została wykonana w Pracowni Oddziaływań Międzycząsteczkowych Wydziału Chemii UW, oraz w Środowiskowym Laboratorium NMR Instytutu Biochemii i Biofizyki PAN.


Pobierz ppt "Wyznaczenie trójwymiarowej struktury inhibitora proteaz serynowych białka SPI-2 i jego mutantów metodami spektroskopii NMR. Urszula Nowicka Promotor: Prof."

Podobne prezentacje


Reklamy Google