Pobieranie prezentacji. Proszę czekać

Pobieranie prezentacji. Proszę czekać

Enzymologia-4 Metody określania struktury enzymów (część II)

Podobne prezentacje


Prezentacja na temat: "Enzymologia-4 Metody określania struktury enzymów (część II)"— Zapis prezentacji:

1 Enzymologia-4 Metody określania struktury enzymów (część II)

2 2. Określanie struktury III- i IV-rzędowej 2.1 Krystalografia i analiza rentgenograficzna białek - krystalizacja białek - aparatura rentgenograficzna - otrzymywanie danych i ich interpretacja - problem fazowy; udokładnianie struktury - rozpraszanie małokątowe (SAS) 2.2 NMR w badaniu struktury przestrzennej białek 2.3 Określanie struktury IV-rzędowej

3

4 Specyficzne cechy kryształów białek - niewielkie rozmiary; zwykle < 1mm; - zawierają zwykle niewiele elementów symetrii, a w konsekwecji wykazują dość proste kształty; - kryształy białek są szczególnie wrażliwe i niestabilne; wynika to z dużej zawartości rozpuszczalnika (zwykle 40 – 70%); - kryształy białek są wrażliwe na zmiany pH, siły jonowej, temperatury; stabilność w niskich temperaturach można poprawić poprze użycie krioprotektantów; - kryształy białek często słabo rozpraszają promieniowanie rentgenowskie, z rozdzielczością niezadowalającą dla otrzymania danych strukturalnych

5 Składniki roztworów używanych do krystalizacji białek i warunki krystalizacji 1.Czynniki wspomagające tworzenie kryształów: siarczan amonu, siarczan litu, siarczan magnezu, siarczan sodu, cytrynian sodu, mrówczan sodu, glikol polietylenowy , 2-metylopentandiol, alkohol polywinylowy, dekstran 2.Stabilizatory: EDTA, ditiotreitol, inhibitory proteaz, detergenty niejonowe (redukują agregację cząsteczek białka) 3.Krioprotektant: glicerol 4.Warunki: temperatura (zwykle 4 C, 15 C, pokojowa), pH (raczej nie pH = pI) Uwaga: warunki sprzyjające tworzeniu zarodków kryształów są często różne od tych, które sprzyjają wzrostowi kryształów Otrzymywanie kryształów kompleksów enzym:ligand -współkrystalizacja enzymu z ligandem -nasączanie kryształów enzymu stężonym roztworem liganda

6 Optymalizacja warunków krystalizacji Testy przesiewowe Metoda kropli siedzącej Metoda kropli wiszącej Mikropłytka stosowana do badań przesiewowych

7 Aparatura do rentgenografii strukturalnej Dyfraktometr

8 Wysokoenergetyczne elektrony są przyśpieszane w akceleratorze kołowym. Kształt orbity biegu elektronów jest kontrolowany przez układ magnesów. Akcelerator o promieniu 200 m umożliwia uzyskanie energii 100 GeV. Wygenerowany strumień promieni X jest wąski i ekstremalnie intensywny (~100 x ). Lokalizacja synchrotronów: USA Cornell, Stanford, Argonne, Los Alamos UK Daresbury France Grenoble (EMBL) Germany Hamburg (EMBL) Japan Photon Factory Synchrotron w Grenoble

9 W klasycznym układzie pomiarowym kryształ jest obracany powoli, prostopadle do monochromatycznej wiązki promieni X. Kryształ umieszczony na pętli włókna Kryształ białka w równowadze z ciekłym rozpuszczalnikiem w cienkościennej kapilarze.

10 Detektory promieniowania X Błona fotograficzna PłytaDetektor FAST Charge-coupled device (CCD)

11 W niższej temperaturze zwiększa się stopień uporządkowania

12 Prawo Bragga 2d sin = Dyfrakcja promieni X - zasady

13

14

15

16 -Z eksperymentu otrzymuje się: fazę + amplitudę fali rozpraszanej przez atom metalu, amplitudę dla samego białka i amplitudę dla kompleksu białko/metal; - można obliczyć, czy interferencja promieni X rozpraszanych przez metal i białko ma charakter wzmocnienia czy wygaszenia; - można oszacować fazę dla białka. Niestety dwa rożne kąty fazowe dają równie dobre rozwiązanie, więc zachodzi konieczność wykorzystania drugiego kompleksu z metalem ciężkim. Tylko jeden z dwóch kątów fazowych z drugiego zestawu danych będzie miał tą samą wartość co jeden z dwóch wyznaczonych poprzednio. Rozwiązywanie problemu fazowego metodą MIR

17 Niezbędne elementy: - zestaw wartości |F 0 (hkl)| dla kryształu białka (struktura docelowa); - koordynaty struktury białka (struktura pomocnicza) podobnego do białka docelowego; - odpowiedniej jakości komputer + oprogramowanie Metoda polega na wielokrotnym, sekwencyjnym ilościowym porównaniu tzw. funkcji Pattersona modelu docelowego i pomocniczego. Inna możliwość: Podstawienie molekularne (MR) Zastosowanie możliwe, gdy są znane dokładne struktury białek podobnych

18 (a) Mapa o niskiej rozdzielczości (5 Å lub więcej – ogólny kształt cząsteczki; (b) Mapa o średniej rozdzielczości (~3 Å) – przebieg łańcucha polipeptydowego możliwość dopasowania znanej sekwencji aminokwasowej do mapy; (c) Mapa o wysokiej rozdzielczosci (1.5 - Å) – jednoznaczna identyfikacja reszt aminokwasowych; (d) Mapa o bardzo wysokiej (atomowej) rozdzielczości (poniżej 1 Å) – atomy jako izolowane kuleczki gęstości elektronowej Rozdzielczość danych dyfrakcyjnych zależy od wielkości kryształu i stopnia jego uporządkowania

19 Metody rozpraszania małokątowego - małokątowe rozpraszanie promieni X (SAXS) - małokątowe rozpraszanie neutronów (SANS) Promienie X lub neutrony są rozpraszane pod kilkoma niewielkimi kątami. Eksperyment przeprowadzany jest w roztworze! Intensywność rozpraszanego promieniowania as a function of scattering angle. mierzy się w w funkcji kąta rozpraszania. Eksperymentalnie otrzymaną zależność porównuje się z zależnością wyliczoną teoretycznie dla proponowanej struktury modelowej.

20 Zastosowanie NMR do badania struktury białek Widmo 1 H NMR niewielkiego białka (< 15 kDa)

21 Spektroskopia NMR Podstawa metody: zjawisko magnetyzmu jądrowego Zasada metody: Znajdujące się w zewnętrznym polu magnetycznym jądra atomów posiadające moment magnetyczny (np. 1 H, 19 F, 14 N, 15 N, 13 C), na które działa promieniowanie elektromagnetyczne o częstotliwości radiowej, absorbują kwanty energii tego promieniowania, przechodząc na wyższy poziom energetyczny. Absorpcję tą określa się jako jądrowy rezonans magnetyczny. Absorpcja energii uwidacznia się jako układ linii spektralnych – sygnałów rezonansowych. Schemat budowy spektrometru NMR

22

23

24

25 2D NMR

26 Przekątna sygnałów (A i B) dzieli widmo na dwie równe połowy. Symetrycznie do tej przekątnej, znajdują się Kolejne sygnały (X), nazywane sygnałami krzyżowymi. Sygnały na przekątnej wynikają z magnetyzacji, która nie została zmieniona przez sekwencję miksującą (równe częstotliwości w obu kierunkach), tzn. z wkładów, które pozostają na tych samych jądrach podczas obu okresów ewolucji. Sygnały krzyżowe pochodzą od jąder, które wymieniły magnetyzację podczas okesu zmieszania (częstotliwości pierwszego i drugiego jądra w każdym kierunku). Sygnały te wskazują na oddziaływania między tymi jądrami. 2D NMR

27

28

29 COSYTOCSY W eksperymencie COSY magnetyzacja jest przenoszona poprzez sprzężenie skalarne. Protony, które są rozdzielone więcej niż trzema wiązaniami chemicznymi nie dają sygnałów krzyżowych, bowiem stałe sprzężenia 4 J są bliskie 0. tak więc, tylko sygnały pochodzące od protonów rozdzielonych dwoma lub trzema wiązaniami występują w widmie COSY (czerwone). Szczególne znaczenie mają sygnały krzy żowe pochodzące od protonów H N i H alpha ponieważ na podstawie stałych sprzężenia 3 J między nimi można określić kąty torsyjne phi szkieletu łańcucha polipeptydowego białka. W ekspermencie TOCSY, magnetyzacja jest rozproszona na cały układ spinowy reszty amiokwasowej w wyniku kolejnych sprzężeń skalarnych. W widmie TOSCY występują zatem nie tylko sygały czerwone (to te same co w widmie COSY), lecz także dodatkowe sygnały (zielone), które są wynikiem oddziaływań wszystkich protonów układu spinowego. 2D NMR

30 Glicyna (z lewej strony) posiada dwa protony H alpha, może być zatem łatwo zidentyfikowana. Walinę (z prawej), leucynę and isoleucynę można łatwo rozróżnić na podstawie sygnałów ich dwóch grup metylowych, które dają characteristyczny układ podwójnych sygnałów między 0 a 1.5 ppm. W podobny sposób można zidentyfikować reszty alaniny i treoniny. 2D NMR białek

31 Eksperyment NOESY ma kluczowe znaczenie dla określania struktury białka. W technice tej wykorzystuje się dipolowe oddziaływania spinowe (jądrowy efekt Overhausera, NOE) dla korelacji protonów. Intensywność NOE jest w pierwszym przybliżeniu proporcjonalna do 1/r 6, gdzie r to odległość pomiędzy Protonami. W praktyce sygnały są obserwowane, gdy r < 5 Å. W eksperymencie NOESY można obserwować sygnały protonów, które znajdują się daleko od siebie w sekwencji aminokwasowej, lecz Blisko w przestzeni, z uwagi na ułożenie łańcucha w trzeciorzędowej strukturze białka. NOESY

32 Sekwencyjny kontakt reszt aminokwasowych można określić na podstawie 2D widma NOESY. Jest to możliwe, ponieważ odległość protonu amidowego reszty (i + 1) od protonów, i reszty (i ) jest prawie zawsze mniejsza niż 5 A. Sekwencyjne sygnały krzyżowe H alpha (i), H beta (i), H gamma (i), etc. są obserwowane przy częstotliwości H N (i+1) (ciemnoniebieskie). Sgnały te można odróznić Od sygnałów wewnątrz reszty poprzez porównaie widm NOESY i TOCSY. Zestaw sekwencyjnych sygnałów krzyżowych pomiędzy H alpha (i) i H N (i+1) określa kolejność i, i+1, i+2,... reszt aminokwasowych w łańcuchu. 2D NMR białek

33 2D heterojądrowy NMR białek Oprócz protonów białka zawierają także inne aktywne magnetycznie jądra. Dla celów spektroskopii NMR wyjątkowe znaczenie mają jądra 15 N i 13 C, szczególnie dla określania struktury większych białek (> 100 AA). Ponieważ jednak naturalna częstotliwość występowania jąder 15 N and 13 C jest bardzo niska, a właściwości magnetyczne dużo mniej korzystne niż jąder 1 H, stosuje się dwa podejścia: wzbogacenie udziału izotopowego jąder 15 N i 13 C w cząsteczkach badanego białka oraz wzmocnienie stosunku sygnału do szumów poprzez wykorzystanie techniki inwersyjnego 2D NMR, w której magnetyzacja przenoszona jest od 1 H do 15 N lub 13 C.. Najważniejszą wersją inwersyjnego NMR jest HSQC (heteronuclear single quantum correlation). Zasada metody na schemacie powyżej. W metodzie tej następuje korelacja atomu azotu grupy NH x z protonem połączonym z tym atomem. Każdy sygnał w widmie HSQC odpowiada protonowi połączonemu z atomem azotu.

34 Etapy odczytywania struktury białka z widma 2D NMR

35 Struktura białka wynikająca z widma NMR to zestaw konformacji o minimalnych energiach.

36 Spektroskopia NMR dużych białek – TROSY TROSY Transverse Relaxation-Optimised SpectroscopY Zastosowanie techniki TROSY pozwala na wyeliminowanie poprzecznej relaksacji spinu jądrowego, która jest bezpośrednią przyczyną rozmycia i zlewania się sygnałów w widmach 2D NMR dużych białek

37 Wzrost ilości rozwiązanych struktur białek i kwasów nukleinowych w latach

38 1.Porównanie wielkości MW białka natywnego (chromatografia rozmiarów wykluczających, ultrawirowanie) oraz zdenaturowanego (SDS-PAGE ) 2. Sieciowanie białka Sieciowane białek w wyniku działania diestru metylowego kwasu suberowego a.sieciowanie; b. analiza SDS-PAGE 3. Określanie stechiometrii wiązania ligandów Określanie czwartorzędowej struktury białka


Pobierz ppt "Enzymologia-4 Metody określania struktury enzymów (część II)"

Podobne prezentacje


Reklamy Google