Pobieranie prezentacji. Proszę czekać

Pobieranie prezentacji. Proszę czekać

Metody NMR stosowane w badaniach biopolimerów

Podobne prezentacje


Prezentacja na temat: "Metody NMR stosowane w badaniach biopolimerów"— Zapis prezentacji:

1 Metody NMR stosowane w badaniach biopolimerów
Część 2: Badania strukturalne białek

2 Badanie struktury białek
Budowa białek Przesunięcia chemiczne w białkach Więzy NMR Ogólna strategia wyznaczania struktur białek Małe białka NOE - odległości H…H Stałe sprzężenia spinowego - kąty dwuścienne Średnie białka Wielowymiarowe korelacje heterojądrowe Widma NOESY redagowane izotopowo Sprzężenia spinowe przez wiązania wodorowe Resztkowe sprzężenia dipolowe Duże białka Deuterowanie i TROSY A. Ejchart, Wiadomości Chemiczne, 2005, 59,

3 Budowa białek Podstawowe aminokwasy naturalne wchodzące
w skład białek.

4 Budowa białek Łączenie aminokwasów w łańcuch polipeptydowy:
struktura pierwszorzędowa Konformację głównego łańcucha polipeptydowego określają kąty , , .

5 Budowa białek Elementy struktury drugorzędowej
helisy, b-kartki, zgięcia, są stabilizowane wiązaniami wodorowymi. Typowe wiązania wodorowe w białkach[Ǻ] hydroksyl-hydroksyl: OHOH 2,80,1 Ǻ hydroksyl-karbonyl: OHO=C 2,80,1 Ǻ amid-karbonyl: >NHO=C 2,90,1 Ǻ amid-hydroksyl: >NHOH 2,90,1 Ǻ amid-azot imidazolowy: >NHN ,10,2 Ǻ amid-siarka: >NHS ,70,2 Ǻ

6 Budowa białek 310: CO(i)···HN(i+3) a: CO(i)···HN(i+4)
Struktura drugorzędowa helisy 310: CO(i)···HN(i+3) a: CO(i)···HN(i+4) p: CO(i)···HN(i+5)

7 (b) antyrównoległa 3-niciowa b kartka
Budowa białek Struktura drugorzędowa b-kartki (b) antyrównoległa 3-niciowa b kartka (c) równoległa 3-niciowa b kartka

8 Budowa białek Przykład – białko S100A1 budowa pierwszorzędowa,
budowa drugorzędowa, budowa trzeciorzędowa, budowa czwartorzędowa.

9

10 Czynniki utrudniające wykorzystanie NMR

11

12 Rybonukleaza (124 reszty, 15 mM, B0 =0,94 T {40 MHz})
M. Saunders, A. Wishnia, J.G. Kirkwood, J. Am. Chem. Soc., 1957, 79, 3289. Lizozym (129 reszt, 1 mM, B0 = 17,6 T {750 MHZ}) J.N.S. Evans, Biomolecular NMR Spectroscopy, Oxford University Press, 1995, str.4

13 Typowe zakresy przesunięć chemicznych w białkach
1H: przypisania – bardzo ważne HN NOE – bardzo ważne Hb, Hg, … 13C: przedziały C' i Ca są odległe d(15N) amidy w łańcuchu głównym oraz łańcuchach bocznych Asn , Gln i Trp: – 130 ppm.

14 Przypisanie sygnałów w widmach izotopów 1H i 13C pozwala
na identyfikację obszarów obejmujących struktury drugorzędowe w oparciu o podejście statystyczne wykorzystując: przesunięcia chemiczne w modelowych peptydach i białkach o znanych strukturach - CSI, D.S. Wishart et al., J. Biomol. NMR, 5, 67-81 (1995) przesunięcia chemiczne w białkach o znanych strukturach krystalograficznych - TALOS, TALOS+ G. Cornilescu, F. Delaglio, A. Bax, J. Biomol. NMR, 13,   (1995) Y. Shen, F. Delaglio, G. Cornilescu, A. Bax, J. Biomol. NMR, 44, (2009) PREDITOR M.V. Berjanskii, S. Neal, D.S. Wishart, Nucl. Acids Res., 34, W63-W69 (2006) CS23D (struktura trzeciorzędowa) D.S. Wishart, D. Arndt, M.V. Berjanskii, P. Tang, J, Zhou, G. Lin, Nucl. Acids Res., 36, W496-W502 (2008)

15 CSI - Chemical Shift Index
Peptyd wiążący jony wapnia.

16 Struktura przestrzenna podjednostki dimerycznego białka S100A1
otrzymana z przesunięć chemicznych (CS23D) i wszystkich więzów (X-PLOR) CS23D X-PLOR

17 Przestrzenna (3D) struktura cząsteczki zbudowanej z N atomów
jest całkowicie zdefiniowana przez (3N - 6) wpółrzędnych wewnętrznych: - odległości międzyatomowe (zwykle długości wiązań), - kąty pomiędzy wiązaniami, - kąty dwuścienne. Długości wiązań i kąty walencyjne są tymi parametrami strukturalnymi, które zwykle charakteryzują się małymi zmianami wartości.

18 Jakie więzy można otrzymać przy pomocy NMR?
 Odległości pomiędzy protonami: W1: jądrowy efekt Overhausera (NOE).  Kąty dwuścienne: W2: wicynalne sprzężenia spinowe (3J).  Odległości pomiędzy donorem i akceptorem w wiązaniu wodorowym: W3: sprzężenia skalarne (nhJ).  Orientacja wektorów międzyjądrowych w molekularnym układzie współrzędnych: W4: resztkowe sprzężenia dipolowe (d).  Wzajemna orientacja wiązań: informacyjnie: interferencja mechanizmów relaksacji (G). Więzy NMR są niejednoznaczne !

19 NOESY - odległości pomiędzy protonami
W1 NOESY - odległości pomiędzy protonami Intensywność sygnału korelacyjnego w widmie NOESY zależy od odległości pomiędzy oddziałującymi jądrami: I ~ dij-6 i szybko maleje z odległością. Warunki dokładnego wyznaczenia odległości: znajomość odległości kalibracyjnej I1/I2 ~ (d1/d2)-6, izotropowa reorientacja dyfuzyjna cząsteczki, wyeliminowanie dyfuzji spinowej (krótkie czasy mieszania), sztywna struktura (brak ruchów segmentowych czy lokalnych).

20 NOESY - odległości kalibracyjne
W1 NOESY - odległości kalibracyjne Jako niezmienne, znane odległości pomiędzy protonami można wybrać: odległości pomiędzy protonami geminalnymi, d  1,8 Å, odległości pomiędzy protonami w resztach aromatycznych np. pomiędzy protonami Hd i He w tyrozynie, d  2,5 Å. NOESY - reorientacja dyfuzyjna cząsteczki Przy anizotropowej reorientacji cząsteczki, wektory HH różniące się kierunkami są scharakteryzowane przez różne czasy korelacji. dyfuzja spinowa

21 NOESY - dyfuzja spinowa
Liniowy układ sześciu spinów: zakł.  1  2  3  4  5  6

22 NOESY - ruchy konformacyjne
W1 NOESY - ruchy konformacyjne Odległość otrzymana z NOE przy uśrednieniu pomiędzy dwoma konformerami o równych populacjach i odległościach H…H: r1 = 2 Å oraz r1 = r2. Przykład: szybkie uśrednienie dwóch konformacji, w których odległości H…H wynoszą 2 Å i 4 Å przy założeniu jednej sztywnej konformacji odpowiada d=2,4 Å.

23 Wicynalne sprzężenia skalarne - kąty dwuścienne
Zależność Karplusa: 3J(F) = A·cos2F + B·cosF + C Mankamenty tego rodzaju więzów: konieczność kalibracji, niejednoznaczność zależności Karplusa. Przykład: jeden z kątów szkieletu białka - . Projekcja Newmana dla  = 0.

24 Wicynalne sprzężenia spinowe - kąty dwuścienne
Doświadczalne zależności dla homo- i heterojądrowych sprzężeń w białkach zależne od kąta dwuściennego . Konieczne znakowanie izotopowe.

25 W2 Wicynalne sprzężenia spinowe - kąty dwuścienne Pomiar homojądrowego sprzężenia spinowego w białku znakowanym 15N.

26 Sprzężenia spinowe przez wiązania wodorowe
h3JNC’: -0,2 do -0,9 Hz kartka b -0,65 ± 0,14 Hz helisa a -0,38 ± 0,12 Hz h2JHC’: -0,6 do 1,3 Hz h3JHCa: 0 do 1,4 Hz Niezbędne jest znakowanie izotopowe 15N/13C

27 Sprzężenia spinowe przez wiązania wodorowe
s, i - niestłumione korelacje sekwencyjne i intrarezydualne

28 Resztkowe sprzężenia dipolowe - RDC
W środowisku izotropowym oddziaływania dipolowe uśredniają się do zera. Jedynym ich przejawem jest obecność jądrowego efektu Overhausera - NOE. W środowisku anizotropowym, wymuszającym częściowe uporządkowanie cząsteczek, pojawiają się resztkowe sprzężenia dipolowe. Ich wielkość zależy od stopnia uporządkowania, ilościowo opisanego przez tensor uporządkowania A. Orientacje wektorów określających oddziaływanie dipolowe danego typu są zdefiniowane w w tym samym układzie osi własnych tensora A dla całej cząsteczki. RDC stanowią więzy dalekozasięgowe

29 Resztkowe sprzężenia dipolowe - RDC
Metody orientowania białek w roztworach Białka paramagnetyczne Wykorzystanie fazy nematycznej (bicelle, fagi, krystality celulozy) Purpurowa membrana (bakteriorodopsyna) Ściśnięty żel poliakrylamidowy bicelle fagi

30 Resztkowe sprzężenia dipolowe - RDC
RDC = DAX·[DAa·(3cos2q  1) + 1.5·DAr·sin2q·cos2f] DAX = m0gAgXh/16p3rAX3 [Hz] DAa = Azz - (Axx  Ayy)/2, DAr = Axx  Ayy D – stała sprzężenia dipolowego, A – tensor uporządkowania. DNH: -24 kHz DCH: 47,9 kHz DHH: kHz Przykładowe sprzężenia dipolowe

31 Resztkowe sprzężenia dipolowe - RDC
Fragmenty widm 1H,15N HSQC dla białka S100A1 znakowanego 15N mierzone w środowisku izotropowym oraz w roztworze zawierającym bicelle. izotropowy anizotropowy

32 Ogólna strategia wyznaczania struktur białek
1) Przypisanie sygnałów. 2) Identyfikacja więzów. 3) Generowanie struktur spełniających więzy doświadczalne. Postępowanie w punktach 1 i 2 zależy od wielkości badanego białka lub kompleksu białkowego. Postępowanie w punkcie 3 zależy od rodzajów i liczby dostępnych więzów.

33 Postępowanie przy wyznaczaniu struktur białek

34

35 Ważne obszary korelacji homojądrowych 1H/1H
fingerprint region

36 Widmo TOCSY heksadekapeptydu; fingerprint region.
Identyfikacja sygnałów należących do poszczególnych reszt i podział według topologii układu spinowego. Asp1-Lys2-Asp3-Gly4-Asp5-Gly6-Tyr7-Ile8-Ser9-Ala10-Ala11-Glu12-Ala13-Ala14-Ala15-Gln16

37 HN–CaH(COO)–CbH(Cg2H3) –Cg1H2–CdH3
Hd (0,76) Korelacje izoleucyny Hg2 (0,86) d(C)=13,1 Hg1 (1,57) Korelacja 1H/13C Hb (1,83) d(C)=17,7 d(H)=0,86 Pierwotne przypisanie d(Hd,Ile) = 0,76 było błędne. d(H)=0,76 d(C)=27,2 Ha (4,47) HN (9,53) HN–CaH(COO)–CbH(Cg2H3) –Cg1H2–CdH3

38 Widmo NOESY heksadekapeptydu, obszar HN/HN.
Asp1-Lys2-Asp3-Gly4-Asp5-Gly6-Tyr7-Ile8-Ser9-Ala10-Ala11-Glu12-Ala13-Ala14-Ala15-Gln16 Widmo NOESY heksadekapeptydu, obszar HN/HN. Przypisania sekwencyjne: sekwencja Lys2 - Tyr7, sekwencja Ala10 - Gln16.

39 Dla białek większych niż 10 kDa widma 2D NOESY stają się nieczytelne.
Fragment widma 2D NOESY interleukiny 1b (17,4 kDa). G.M. Clore, L.E. Kay, A. Bax, A.M. Gronenborn Biochemistry, 30, (1991).

40 Wielowymiarowa spektroskopia NMR
Homo- czy heterojądrowe techniki NMR ? - Do pomiarów heterojądrowych konieczne jest wzbogacenie izotopowe 15N/13C. - Czułość sekwencji heterojądrowych 3D jest większa niż homojądrowych 3D i porównywalna z czułością sekwencji homojądrowych 2D. - Przeniesienie koherencji jest wydajne wtedy, gdy szerokości połówkowe sygnałów nie są większe niż stałe sprzężenia skalarnego. Korelacje homojądrowe: J(HH)<18 Hz. Korelacje heterojądrowe: J(CH)<120 Hz, J(NH)90 Hz. - Liczba sygnałów w widmach homojądrowych szybko rośnie z liczbą wymiarów zwiększając stłoczenie i zmniejszając czułość, zaś w widmach heterojądrowych pojawiają się jedynie specyficzne sygnały korelacyjne. - Przesunięcia chemiczne heterojąder zwiększają rozproszenie sygnałów.

41

42 W widmach korelacyjnych do przeniesienia magnetyzacji
wykorzystuje się sieć sprzężeń spinowych 1J i 2J, które zazwyczaj mają duże wartości. Znakowanie, oprócz zwiększenia czułości pomiaru, tworzy sieć aktywnych magnetycznie heterojąder co umożliwia przenoszenie magnetyzacji wzdłuż szkieletu białka.

43 Dlaczego większość widm NMR białek mierzy się w H2O ?
Podwójnie znakowane 15N/13C-S100A1 30 min po rozpuszczeniu tydzień po rozpuszczeniu Rozpuszczalnik H2O Rozpuszczalnik D2O

44 można realizować na dwa sposoby "out and back" oraz "one way" transfer
Schemat Hexc→X→Hdet można realizować na dwa sposoby "out and back" oraz "one way" transfer nazewnictwo one way out and back one way: Ha→Ca(t1)→N(t2)→HN(t3); (H)CANNH out and back: HN→N→Ca(t1)→N(t2)→HN(t3); HNCA Uwzględniając relaksację schemat "out and back" jest w tym przypadku 4 razy czulszy

45 Przypisania sygnałów łańcucha głównego
Podstawowe widmo: 2D 1H-15N HSQC koreluje: Ni, HNi Przykład: białko holo-S100A1, tionylowane homocysteiną na Cys85, 2*93 reszty aminokwasowe, m.cz. 21 kDa. Dalsze dane widmowe dla tego samego białka.

46 Przypisania sygnałów łańcucha głównego
1J(NiC'i-1) = 15 Hz; 2J(NiC'i) ≈ 0 Hz 1J(NiC'ai) = 11 Hz; 2J(NiC'ai-1) = 7 Hz d(C'): ppm; d(Ca): ppm Wartości stałych J prowadzą do par widm korelacyjnych HN(CO)CA: Ni, HNi, Cai-1; HNCA: Ni, HNi, Cai, Cai-1

47 Przypisania sygnałów łańcucha głównego
HN(CO)CA: Ni, HNi, Cai-1 HNCA: Ni, HNi, Cai, Cai-1

48 Przypisania sygnałów łańcucha głównego
HNCO: Ni, HNi, C'i-1; (HCA)CO(CA)NH: Ni, HNi, C'i, C'i-1 one way: Ha→Ca→C'(t1)→Ca→N(t2)→HN(t3); (HCA)CO(CA)NH out and back:HN→N→C'(t1)→N(t2)→HN(t3); HN(CA)CO W tym przypadku transfer „one way" jest czulszy niż "out and back". Para widm najbardziej różniących się czułością.

49 Przypisania sygnałów łańcucha głównego
HNCO: Ni, HNi, C'i-1 (HCA)CO(CA)NH: Ni, HNi, C'i, C'i-1

50 Przypisania sygnałów łańcucha głównego
(HBHA)CBCA(CO)NH: Ni, HNi, Cai-1, Cbi-1 (one way) HNCACB: Ni, HNi, Cai-1, Cbi-1, Ca1, Cbi (out and back) HaHb→CaCb(t1)→C'→N(t2)→HN(t3); (HBHA)CBCA(CO)NH HN→N→CaCb(t1)→N(t2)→HN(t3); HNCACB

51 Przypisania sygnałów łańcucha głównego
(HBHA)CBCA(CO)NH: Ni, HNi, Cai-1, Cbi-1 HNCACB: Ni, HNi, Cai-1, Cbi-1, Ca1, Cbi

52 Przypisania sygnałów łańcucha głównego
Kolejna para komplementarnych sekwencji impulsowych do wykonania w przypadku potrzeby. HBHA(CBCACO)NH: Ni, NHi, Hai-1, Hbi-1 HBHA(CBCA)NH: Ni, HNi, Hai-1, Hbi-1, Hai, Hbi Skorelowane grupy 12 sygnałów dwóch sąsiadujących reszt Wymagają ułożenia pasujących odpowiednio grup: Ni, HNi, C'i-1, Cai-1, Cbi-1, Hai-1, Hbi-1, C'i, Cai, Cbi, Hai, Hbi Ni+1, HNi+1, C'i, Cai, Cbi, Hai, Hbi, C'i+1, Cai+1, Cbi+1, Hai+1, Hbi+1

53 Przypisania sygnałów łańcuchów bocznych
Szczególnie ważne są przypisania sygnałów 1H, gdyż są konieczne do identyfikacji kontaktów NOE. Dwie sekwencje pozwalające na przypisania prawie wszystkich jąder C i H reszty poprzedzającej NH: (H)C(CO)NH i H(CCO)NH Uzupełniające sekwencje: HC(C)H -TOCSY i (H)CCH -TOCSY Przypisania automatyczne - MARS

54 Podstawowe widma 2D 1H-13C HSQC korelują: C/H alifatyczne aromatyczne

55 Paski z widma (H)C(CO)NH Resztą poprzedzającą Tyr26 jest Lys25 Łańcuchy boczne: K: CbH2CgH2CdH2CeH2NH2 Y: CbH2 L: CbH2CgH(Cd1H3)Cd2H3 S: CbH2OH

56 Jądrowy efekt Overhausera
Widma NOESY edytowane izotopowo 15N i 13C 15N-edytowane NOESY: HN,C(t1) → HN→N(t2)→HN(t3); HN/HN, HC/HN 13C-edytowane NOESY: HN,C(t1) → HC→C(t2)→HC(t3); HN/HC, HC/HC NOE NOE Dodatkowe etapy przeniesienia magnetyzacji stwarzają nowe możliwości: a) wyboru, b) liczby wymiarów HN,C→N→HN(t1) → HN→N(t2)→HN(t3); HN/HN HN,C→C(t1)→HC(t2) → HC→C(t3)→HC(t4); HC/HC NOE NOE

57 15N-edytowane NOESY

58 13C-edytowane NOESY Leucyna: L: CbH2CgH(Cd1H3)Cd2H3 a b g d1 d2

59

60 Półautomatyczna lub ręczna identyfikacja więzów NOE
Kalibracja i półilościowy podział według intensywności: silne (2.0 Å – 3.5 Å) średnie (2.0 Å – 4.5 Å) słabe (2.0 Å – 5.5 Å) b. słabe (2.0 Å – 6.0 Å) Pułapki: - niejednoznaczność więzów, - nałożenie sygnałów korelacyjnych, - dyfuzja spinowa, - silna anizotropia dyfuzji rotacyjnej.

61 Zestawy więzów służą jako dane wejściowe dla różnych
programów (CYANA, CNS, X-PLOR). Przykład statystyki więzów użytych do obliczenia struktury dimerycznego białka S100A1 NOE distance constraints within subunit intraresidual & sequential (|i-j| ≤ 1) medium-range (1 < |i-j| < 5) long-range (|i-j| ≥ 5) 1240 723 270 247 Intersubunit NOE distance constraints per subunit 158 Hydrogen bonds constraints 50 Restraints per residue Restraints for calcium coordination per subunit 15.6 10 Torsion angle constraints backbone (φ/ψ) side chains (χ1, χ2) 67/67 0/0

62 Rysunek rodziny 20 najniżej struktur dla holo-S100A1-Hcy
Nałożenie 20 struktur po atomach głównego łańcucha. Struktura wstążkowa. Zaznaczono jony Ca2+ oraz homocysteinę.

63

64 Znakowanie izotopowe Jednolite znakowanie 15N, 13C, 2H - ekspresja białek w: - bakteriach (E. coli), - drożdżach (P. pastoris), - komórkach zainfekowanych bakulowirusem, - pozakomórkowo. Przy ekspresji w E. coli konieczne jest stosowanie pożywek minimalnych; źródło 15N: sole amonowe (chlorek, azotan, siarczan), źródło 13C: glukoza, kwas pirogronowy, octowy, bursztynowy, glicerol. Spadek wydajności w stosunku do pełnej pożywki: glukoza - 2x, kw. pirogronowy - 4x źródło 2H: D2O, glicerol-2H8 w D2O. E. coli źle rośnie w ciężkiej wodzie.

65 Znakowanie izotopowe Selektywne znakowanie wybranych grup (np. grup metylowych) 1H/13C kwas pirogronowy (jedyne źródło węgla) w D2O, protonowane grupy metylowe: d-Leu, g-Val, g2-Ile, b-Ala ~20% protonowanie Cb, powstają izotopomery CH3, CH2D, CHD2. kwas [4-13C]-a-ketomasłowy: [13Cd1]-Ile, kwas [4,4’-13C]-a-ketoizowalerianowy: [13Cd]-Leu, [13Cg]-Val. Częściowe deuterowanie (50 – 85%) Znakowanie segmentowe (łączenie białek - protein splicing) domena zwana inteiną jest autokatalitycznie wycinana z powstałego białka trans-splicing (może być kilkukrotny) ligacja chemiczna ograniczenia: zszycie w obszarze pętli, na złączach określone aminokwasy.

66 Deuterowanie Widma 1H,15N-HSQC Białko [2H/15H]EIN E. coli (30 kDa).
D.S. Garret, Y.J. Seok, D.I. Liao, A. Peterkofsky, A.M. Gronenborn, G.M. Clore Biochemistry, 36, (1997).

67 Deuterowanie Widma H(N)CA kalcyneuryny B (19,7 kDa):
(A) [15N/13C], HW25 Hz, (B) [15N/13C/85%-2H] odsprzęganie 2H, HW10 Hz. Widoczne sprzężenie skalarne 1J(CaCb)35 Hz. S. Grzesiek, J. Anglister, H. Ren, A. Bax J. Am. Chem. Soc., 115, (1993).

68 Selektywne znakowanie grup metylowych [1H/13C]kwasem pirogronowym.
Widma 1H,13C-HSQC białka PLCC SH2 (a) 13C/1H (b) 13C/2H /1H3C M.K. Rosen, K.H. Gardner, R.C. Willis, W.E. Parris, T. Pawson, L.E. Kay J. Mol. Biol., 263, (1996).

69 TROSY - transverse relaxation optimized spectroscopy

70 TROSY - transverse relaxation optimized spectroscopy
Sygnał grupy indolowej NH w tryptofanie: (a) HSQC z odsprzęganiem w obu wymiarach, (b) HSQC bez odsprzęgania, (c) 15N,1H-TROSY G. Wider, K. Wüthrich, Curr. Opin. Struct. Biol., 9, (1999).

71 Deuterowanie i TROSY Widma HSQC (a) i TROSY (b)15N,2H- gyrazy-45 ze Staphylococcus aureus (45 kDa). G. Wider, K. Wüthrich, Curr. Opin. Struct. Biol., 9, (1999).

72 Zagadnienia dotyczące NMR białek,
które nie zostały poruszone w wykładzie Oddziaływanie białek z małymi ligandami trNOE, trRDC. Dynamika cząsteczkowa magnetyczna relaksacja jądrowa, wymiana chemiczna. Kompleksy białkowe i oligomery filtrowanie izotopowe, techniki redagowania. Białka paramagnetyczne. Bałka membranowe techniki NMR ciała stałego.


Pobierz ppt "Metody NMR stosowane w badaniach biopolimerów"

Podobne prezentacje


Reklamy Google