Pobieranie prezentacji. Proszę czekać

Pobieranie prezentacji. Proszę czekać

Metody NMR stosowane w badaniach biopolimerów Część 2: Badania strukturalne białek.

Podobne prezentacje


Prezentacja na temat: "Metody NMR stosowane w badaniach biopolimerów Część 2: Badania strukturalne białek."— Zapis prezentacji:

1 Metody NMR stosowane w badaniach biopolimerów Część 2: Badania strukturalne białek

2 Badanie struktury białek Budowa białek Przesunięcia chemiczne w białkach Więzy NMR Ogólna strategia wyznaczania struktur białek Małe białka NOE - odległości H…H Stałe sprzężenia spinowego - kąty dwuścienne Średnie białka Wielowymiarowe korelacje heterojądrowe Widma NOESY redagowane izotopowo Sprzężenia spinowe przez wiązania wodorowe Resztkowe sprzężenia dipolowe Duże białka Deuterowanie i TROSY A. Ejchart, Wiadomości Chemiczne, 2005, 59,

3 Budowa białek Podstawowe aminokwasy naturalne wchodzące w skład białek.

4 Budowa białek Łączenie aminokwasów w łańcuch polipeptydowy: struktura pierwszorzędowa Konformację głównego łańcucha polipeptydowego określają kąty,,.

5 Budowa białek Elementy struktury drugorzędowej helisy, -kartki, zgięcia, są stabilizowane wiązaniami wodorowymi. Typowe wiązania wodorowe w białkach[Ǻ] hydroksyl-hydroksyl: O H OH 2,8 0,1 Ǻ hydroksyl-karbonyl: O H O=C 2,8 0,1 Ǻ amid-karbonyl: >N H O=C 2,9 0,1 Ǻ amid-hydroksyl: >N H OH 2,9 0,1 Ǻ amid-azot imidazolowy: >N H N 3,1 0,2 Ǻ amid-siarka: >N H S 3,7 0,2 Ǻ

6 Budowa białek Struktura drugorzędowa helisy 3 10 : CO(i)···HN(i+3) : CO(i)···HN(i+4) : CO(i)···HN(i+5)

7 Budowa białek Struktura drugorzędowa -kartki (b) antyrównoległa 3-niciowa kartka (c) równoległa 3-niciowa kartka

8 Budowa białek Przykład – białko S100A1 budowa pierwszorzędowa, budowa drugorzędowa, budowa trzeciorzędowa, budowa czwartorzędowa.

9

10 Czynniki utrudniające wykorzystanie NMR

11

12 Rybonukleaza (124 reszty, 15 mM, B 0 =0,94 T {40 MHz}) M. Saunders, A. Wishnia, J.G. Kirkwood, J. Am. Chem. Soc., 1957, 79, Lizozym (129 reszt, 1 mM, B 0 = 17,6 T {750 MHZ}) J.N.S. Evans, Biomolecular NMR Spectroscopy, Oxford University Press, 1995, str.4

13 Typowe zakresy przesunięć chemicznych w białkach ( 15 N) amidy w łańcuchu głównym oraz łańcuchach bocznych Asn, Gln i Trp: 105 – 130 ppm. 1 H: przypisania – bardzo ważne H N NOE – bardzo ważne H, H, … 13 C: przedziały C' i C są odległe

14 Przypisanie sygnałów w widmach izotopów 1 H i 13 C pozwala na identyfikację obszarów obejmujących struktury drugorzędowe w oparciu o podejście statystyczne wykorzystując: przesunięcia chemiczne w modelowych peptydach i białkach o znanych strukturach - CSI, D.S. Wishart et al., J. Biomol. NMR, 5, (1995) przesunięcia chemiczne w białkach o znanych strukturach krystalograficznych - TALOS, TALOS+ G. Cornilescu, F. Delaglio, A. Bax, J. Biomol. NMR, 13, (1995) Y. Shen, F. Delaglio, G. Cornilescu, A. Bax, J. Biomol. NMR, 44, (2009) PREDITOR M.V. Berjanskii, S. Neal, D.S. Wishart, Nucl. Acids Res., 34, W63-W69 (2006) CS23D (struktura trzeciorzędowa) D.S. Wishart, D. Arndt, M.V. Berjanskii, P. Tang, J, Zhou, G. Lin, Nucl. Acids Res., 36, W496-W502 (2008)

15 CSI - Chemical Shift Index Peptyd wiążący jony wapnia.

16 CS23DX-PLOR Struktura przestrzenna podjednostki dimerycznego białka S100A1 otrzymana z przesunięć chemicznych (CS23D) i wszystkich więzów (X-PLOR)

17 Przestrzenna (3D) struktura cząsteczki zbudowanej z N atomów jest całkowicie zdefiniowana przez (3N - 6) wpółrzędnych wewnętrznych: - odległości międzyatomowe (zwykle długości wiązań), - kąty pomiędzy wiązaniami, - kąty dwuścienne. Długości wiązań i kąty walencyjne są tymi parametrami strukturalnymi, które zwykle charakteryzują się małymi zmianami wartości.

18 Jakie więzy można otrzymać przy pomocy NMR? Odległości pomiędzy protonami: W1: jądrowy efekt Overhausera (NOE). Kąty dwuścienne: W2: wicynalne sprzężenia spinowe ( 3 J). Odległości pomiędzy donorem i akceptorem w wiązaniu wodorowym: W3: sprzężenia skalarne ( nh J). Orientacja wektorów międzyjądrowych w molekularnym układzie współrzędnych: W4: resztkowe sprzężenia dipolowe ( ). Wzajemna orientacja wiązań: informacyjnie: interferencja mechanizmów relaksacji ( ). Więzy NMR są niejednoznaczne !

19 NOESY - odległości pomiędzy protonami Intensywność sygnału korelacyjnego w widmie NOESY zależy od odległości pomiędzy oddziałującymi jądrami: I ~ d ij -6 i szybko maleje z odległością. Warunki dokładnego wyznaczenia odległości: znajomość odległości kalibracyjnej I 1 /I 2 ~ (d 1 /d 2 ) -6, izotropowa reorientacja dyfuzyjna cząsteczki, wyeliminowanie dyfuzji spinowej (krótkie czasy mieszania), sztywna struktura (brak ruchów segmentowych czy lokalnych). W1

20 NOESY - odległości kalibracyjne Jako niezmienne, znane odległości pomiędzy protonami można wybrać: odległości pomiędzy protonami geminalnymi, d 1,8 Å, odległości pomiędzy protonami w resztach aromatycznych np. pomiędzy protonami H i H w tyrozynie, d 2,5 Å. NOESY - reorientacja dyfuzyjna cząsteczki dyfuzja spinowa Przy anizotropowej reorientacji cząsteczki, wektory HH różniące się kierunkami są scharakteryzowane przez różne czasy korelacji. W1

21 NOESY - dyfuzja spinowa Liniowy układ sześciu spinów: zakł W1

22 NOESY - ruchy konformacyjne Odległość otrzymana z NOE przy uśrednieniu pomiędzy dwoma konformerami o równych populacjach i odległościach H…H: r 1 = 2 Å oraz r 1 = r 2. W1 Przykład: szybkie uśrednienie dwóch konformacji, w których odległości H…H wynoszą 2 Å i 4 Å przy założeniu jednej sztywnej konformacji odpowiada d=2,4 Å.

23 Wicynalne sprzężenia skalarne - kąty dwuścienne W2 Przykład: jeden z kątów szkieletu białka -. Projekcja Newmana dla = 0. Zależność Karplusa: 3 J( ) = A·cos 2 + B·cos + C Mankamenty tego rodzaju więzów:konieczność kalibracji, niejednoznaczność zależności Karplusa.

24 Wicynalne sprzężenia spinowe - kąty dwuścienne W2 Doświadczalne zależności dla homo- i heterojądrowych sprzężeń w białkach zależne od kąta dwuściennego. Konieczne znakowanie izotopowe.

25 Pomiar homojądrowego sprzężenia spinowego w białku znakowanym 15 N. Wicynalne sprzężenia spinowe - kąty dwuścienne W2

26 Sprzężenia spinowe przez wiązania wodorowe h3 J NC : -0,2 do -0,9 Hz h2 J HC : -0,6 do 1,3 Hz h3 J HC : 0 do 1,4 Hz Niezbędne jest znakowanie izotopowe 15 N/ 13 C kartka -0,65 ± 0,14 Hz helisa -0,38 ± 0,12 Hz W3

27 Sprzężenia spinowe przez wiązania wodorowe s, i - niestłumione korelacje sekwencyjne i intrarezydualne W3

28 Resztkowe sprzężenia dipolowe - RDC W środowisku izotropowym oddziaływania dipolowe uśredniają się do zera. Jedynym ich przejawem jest obecność jądrowego efektu Overhausera - NOE. W środowisku anizotropowym, wymuszającym częściowe uporządkowanie cząsteczek, pojawiają się resztkowe sprzężenia dipolowe. Ich wielkość zależy od stopnia uporządkowania, ilościowo opisanego przez tensor uporządkowania A. Orientacje wektorów określających oddziaływanie dipolowe danego typu są zdefiniowane w w tym samym układzie osi własnych tensora A dla całej cząsteczki. RDC stanowią więzy dalekozasięgowe W4

29 Resztkowe sprzężenia dipolowe - RDC bicellefagi Metody orientowania białek w roztworach Białka paramagnetyczne Wykorzystanie fazy nematycznej (bicelle, fagi, krystality celulozy) Purpurowa membrana (bakteriorodopsyna) Ściśnięty żel poliakrylamidowy W4

30 Resztkowe sprzężenia dipolowe - RDC D NH : -24 kHz D CH : 47,9 kHz D HH : kHz Przykładowe sprzężenia dipolowe RDC = D AX ·[ A a ·(3cos 2 1) + 1.5· A r ·sin 2 ·cos2 ] D AX = 0 A X h/16 3 r AX 3 [Hz] A a = A zz - (A xx A yy )/2, A r = A xx A yy D – stała sprzężenia dipolowego, A – tensor uporządkowania.

31 W4 Resztkowe sprzężenia dipolowe - RDC Fragmenty widm 1 H, 15 N HSQC dla białka S100A1 znakowanego 15 N mierzone w środowisku izotropowym oraz w roztworze zawierającym bicelle. izotropowyanizotropowy

32 Ogólna strategia wyznaczania struktur białek 1) Przypisanie sygnałów. 2) Identyfikacja więzów. 3) Generowanie struktur spełniających więzy doświadczalne. Postępowanie w punktach 1 i 2 zależy od wielkości badanego białka lub kompleksu białkowego. Postępowanie w punkcie 3 zależy od rodzajów i liczby dostępnych więzów.

33 Postępowanie przy wyznaczaniu struktur białek

34

35 Ważne obszary korelacji homojądrowych 1 H/ 1 H fingerprint region

36 Widmo TOCSY heksadekapeptydu; fingerprint region. Identyfikacja sygnałów należących do poszczególnych reszt i podział według topologii układu spinowego. Asp 1 -Lys 2 -Asp 3 -Gly 4 -Asp 5 -Gly 6 -Tyr 7 -Ile 8 -Ser 9 -Ala 10 -Ala 11 -Glu 12 -Ala 13 -Ala 14 -Ala 15 -Gln 16

37 H (0,76) H 2 (0,86) H 1 (1,57) H (1,83) H (4,47) H N (9,53) HN–C H(COO)–C H(C 2 H 3 ) –C 1 H 2 –C H 3 Korelacje izoleucyny (H)=0,86 (H)=0,76 Korelacja 1 H/ 13 C Pierwotne przypisanie (H Ile ) = 0,76 było błędne. (C)=13,1 (C)=17,7 (C)=27,2

38 Widmo NOESY heksadekapeptydu, obszar H N /H N. Asp 1 -Lys 2 -Asp 3 -Gly 4 -Asp 5 -Gly 6 -Tyr 7 -Ile 8 -Ser 9 -Ala 10 -Ala 11 -Glu 12 -Ala 13 -Ala 14 -Ala 15 -Gln 16 Przypisania sekwencyjne: sekwencja Lys2 - Tyr7, sekwencja Ala10 - Gln16.

39 Dla białek większych niż 10 kDa widma 2D NOESY stają się nieczytelne. Fragment widma 2D NOESY interleukiny 1 (17,4 kDa). G.M. Clore, L.E. Kay, A. Bax, A.M. Gronenborn Biochemistry, 30, (1991).

40 Homo- czy heterojądrowe techniki NMR ? - Do pomiarów heterojądrowych konieczne jest wzbogacenie izotopowe 15 N/ 13 C. - Czułość sekwencji heterojądrowych 3D jest większa niż homojądrowych 3D i porównywalna z czułością sekwencji homojądrowych 2D. - Przeniesienie koherencji jest wydajne wtedy, gdy szerokości połówkowe sygnałów nie są większe niż stałe sprzężenia skalarnego. Korelacje homojądrowe: J(HH)<18 Hz. Korelacje heterojądrowe: J(CH)<120 Hz, J(NH) 90 Hz. - Liczba sygnałów w widmach homojądrowych szybko rośnie z liczbą wymiarów zwiększając stłoczenie i zmniejszając czułość, zaś w widmach heterojądrowych pojawiają się jedynie specyficzne sygnały korelacyjne. - Przesunięcia chemiczne heterojąder zwiększają rozproszenie sygnałów. Wielowymiarowa spektroskopia NMR

41

42 W widmach korelacyjnych do przeniesienia magnetyzacji wykorzystuje się sieć sprzężeń spinowych 1 J i 2 J, które zazwyczaj mają duże wartości. Znakowanie, oprócz zwiększenia czułości pomiaru, tworzy sieć aktywnych magnetycznie heterojąder co umożliwia przenoszenie magnetyzacji wzdłuż szkieletu białka.

43 Rozpuszczalnik H 2 O Rozpuszczalnik D 2 O 30 min po rozpuszczeniu tydzień po rozpuszczeniu Dlaczego większość widm NMR białek mierzy się w H 2 O ? Podwójnie znakowane 15 N/ 13 C-S100A1

44 Schemat H exc XH det można realizować na dwa sposoby "out and back" oraz "one way" transfer one wayout and back one way: HC (t 1 ) N(t 2 ) H N (t 3 ); (H)CANNH out and back: H NN C (t 1 ) N(t 2 ) H N (t 3 ); HNCA Uwzględniając relaksację schemat "out and back" jest w tym przypadku 4 razy czulszy nazewnictwo

45 Przypisania sygnałów łańcucha głównego Podstawowe widmo: 2D 1 H- 15 N HSQC koreluje: N i, H Ni Przykład: białko holo-S100A1, tionylowane homocysteiną na Cys85, 2*93 reszty aminokwasowe, m.cz. 21 kDa. Dalsze dane widmowe dla tego samego białka.

46 Przypisania sygnałów łańcucha głównego 1 J(N i C' i-1 ) = 15 Hz; 2 J(N i C' i ) 0 Hz 1 J(N i C' i ) = 11 Hz; 2 J(N i C' i-1 ) = 7 Hz (C'): ppm; (C ): ppm Wartości stałych J prowadzą do par widm korelacyjnych HN(CO)CA: N i, H Ni, C i-1 ; HNCA: N i, H Ni, C i, C i-1

47 Przypisania sygnałów łańcucha głównego HNCA: N i, H Ni, C i, C i-1 HN(CO)CA: N i, H Ni, C i-1

48 Przypisania sygnałów łańcucha głównego HNCO: N i, H Ni, C' i-1 ; (HCA)CO(CA)NH: N i, H Ni, C' i, C' i-1 one way: HC C'(t 1 )CN(t 2 ) H N (t 3 ); (HCA)CO(CA)NH out and back:H NN C'(t 1 ) N(t 2 ) H N (t 3 ); HN(CA)CO W tym przypadku transfer one way" jest czulszy niż "out and back". Para widm najbardziej różniących się czułością.

49 Przypisania sygnałów łańcucha głównego HNCO: N i, H Ni, C' i-1 (HCA)CO(CA)NH: N i, H Ni, C' i, C' i-1

50 Przypisania sygnałów łańcucha głównego H H C C (t 1 ) C'N(t 2 ) H N (t 3 ); (HBHA)CBCA(CO)NH H NN C C (t 1 ) N(t 2 ) H N (t 3 ); HNCACB (HBHA)CBCA(CO)NH: N i, H Ni, C i-1, C i-1 (one way) HNCACB: N i, H Ni, C i-1, C i-1, C 1, C i (out and back)

51 Przypisania sygnałów łańcucha głównego HNCACB: N i, H Ni, C i-1, C i-1, C 1, C i (HBHA)CBCA(CO)NH: N i, H Ni, C i-1, C i-1

52 Przypisania sygnałów łańcucha głównego Kolejna para komplementarnych sekwencji impulsowych do wykonania w przypadku potrzeby. HBHA(CBCACO)NH: N i, N Hi, H i-1, H i-1 HBHA(CBCA)NH: N i, H Ni, H i-1, H i-1, H i, H i Skorelowane grupy 12 sygnałów dwóch sąsiadujących reszt Wymagają ułożenia pasujących odpowiednio grup: N i, H Ni, C' i-1, C i-1, C i-1, H i-1, H i-1, C' i, C i, C i, H i, H i N i+1, H Ni+1, C' i, C i, C i, H i, H i, C' i+1, C i+1, C i+1, H i+1, H i+1

53 Przypisania sygnałów łańcuchów bocznych Szczególnie ważne są przypisania sygnałów 1 H, gdyż są konieczne do identyfikacji kontaktów NOE. Dwie sekwencje pozwalające na przypisania prawie wszystkich jąder C i H reszty poprzedzającej NH: (H)C(CO)NH i H(CCO)NH Uzupełniające sekwencje: HC(C)H -TOCSY i (H)CCH -TOCSY Przypisania automatyczne - MARS

54 Podstawowe widma 2D 1 H- 13 C HSQC korelują: C/H alifatyczne aromatyczne

55 Paski z widma (H)C(CO)NH Resztą poprzedzającą Tyr26 jest Lys25 Łańcuchy boczne: K: C H 2 C H 2 C H 2 C H 2 NH 2 Y: C H 2 L: C H 2 C H(C 1 H 3 )C 2 H 3 S: C H 2 OH

56 Jądrowy efekt Overhausera Widma NOESY edytowane izotopowo 15 N i 13 C 15 N-edytowane NOESY: H N,C (t 1 ) H N N(t 2 ) H N (t 3 ); H N /H N, H C /H N 13 C-edytowane NOESY: H N,C (t 1 ) H C C(t 2 ) H C (t 3 ); H N /H C, H C /H C NOE Dodatkowe etapy przeniesienia magnetyzacji stwarzają nowe możliwości: a) wyboru, b) liczby wymiarów H N,C N H N (t 1 ) H N N(t 2 ) H N (t 3 ); H N /H N H N,C C(t 1 ) H C (t 2 ) H C C(t 3 ) H C (t 4 ); H C /H C NOE

57 15 N-edytowane NOESY

58 13 C-edytowane NOESY Leucyna: L: C H 2 C H(C 1 H 3 )C 2 H 3

59

60 Półautomatyczna lub ręczna identyfikacja więzów NOE Kalibracja i półilościowy podział według intensywności: silne (2.0 Å – 3.5 Å) średnie (2.0 Å – 4.5 Å) słabe (2.0 Å – 5.5 Å) b. słabe (2.0 Å – 6.0 Å) Pułapki: - niejednoznaczność więzów, - nałożenie sygnałów korelacyjnych, - dyfuzja spinowa, - silna anizotropia dyfuzji rotacyjnej.

61 Zestawy więzów służą jako dane wejściowe dla różnych programów (CYANA, CNS, X-PLOR). Przykład statystyki więzów użytych do obliczenia struktury dimerycznego białka S100A1 NOE distance constraints within subunit intraresidual & sequential (|i-j| 1) medium-range (1 < |i-j| < 5) long-range (|i-j| 5) Intersubunit NOE distance constraints per subunit158 Hydrogen bonds constraints50 Restraints per residue Restraints for calcium coordination per subunit Torsion angle constraints backbone (φ/ψ) side chains (χ 1, χ 2 ) 67/67 0/0

62 Rysunek rodziny 20 najniżej struktur dla holo-S100A1-Hcy Nałożenie 20 struktur po atomach głównego łańcucha. Struktura wstążkowa. Zaznaczono jony Ca 2+ oraz homocysteinę.

63

64 Znakowanie izotopowe Jednolite znakowanie 15 N, 13 C, 2 H - ekspresja białek w: - bakteriach (E. coli), - drożdżach (P. pastoris), - komórkach zainfekowanych bakulowirusem, - pozakomórkowo. Przy ekspresji w E. coli konieczne jest stosowanie pożywek minimalnych; źródło 15 N: sole amonowe (chlorek, azotan, siarczan), źródło 13 C: glukoza, kwas pirogronowy, octowy, bursztynowy, glicerol. Spadek wydajności w stosunku do pełnej pożywki: glukoza - 2x, kw. pirogronowy - 4x źródło 2 H: D 2 O, glicerol- 2 H 8 w D 2 O. E. coli źle rośnie w ciężkiej wodzie.

65 Selektywne znakowanie wybranych grup (np. grup metylowych) 1 H/ 13 C kwas pirogronowy (jedyne źródło węgla) w D 2 O, protonowane grupy metylowe: -Leu, -Val, 2-Ile, -Ala ~20% protonowanie C, powstają izotopomery CH 3, CH 2 D, CHD 2. kwas [4- 13 C]- -ketomasłowy: [ 13 C 1 ]-Ile, kwas [4,4- 13 C]- -ketoizowalerianowy: [ 13 C ]-Leu, [ 13 C ]-Val. Częściowe deuterowanie (50 – 85%) Znakowanie segmentowe (łączenie białek - protein splicing) domena zwana inteiną jest autokatalitycznie wycinana z powstałego białka trans-splicing (może być kilkukrotny) ligacja chemiczna ograniczenia: zszycie w obszarze pętli, na złączach określone aminokwasy. Znakowanie izotopowe

66 Deuterowanie Widma 1 H, 15 N-HSQC Białko [ 2 H/ 15 H]EIN E. coli (30 kDa). D.S. Garret, Y.J. Seok, D.I. Liao, A. Peterkofsky, A.M. Gronenborn, G.M. Clore Biochemistry, 36, (1997).

67 Widma H(N)CA kalcyneuryny B (19,7 kDa): (A) [ 15 N/ 13 C], HW 25 Hz, (B) [ 15 N/ 13 C/85%- 2 H] odsprzęganie 2 H, HW 10 Hz. Widoczne sprzężenie skalarne 1 J(C C ) 35 Hz. S. Grzesiek, J. Anglister, H. Ren, A. Bax J. Am. Chem. Soc., 115, (1993). Deuterowanie

68 Selektywne znakowanie grup metylowych [ 1 H/ 13 C]kwasem pirogronowym. M.K. Rosen, K.H. Gardner, R.C. Willis, W.E. Parris, T. Pawson, L.E. Kay J. Mol. Biol., 263, (1996). Widma 1 H, 13 C-HSQC białka PLCC SH2 (a) 13 C/ 1 H (b) 13 C/ 2 H / 1 H 3 C

69 TROSY - transverse relaxation optimized spectroscopy

70 Sygnał grupy indolowej NH w tryptofanie: (a) HSQC z odsprzęganiem w obu wymiarach, (b) HSQC bez odsprzęgania, (c) 15 N, 1 H-TROSY G. Wider, K. Wüthrich, Curr. Opin. Struct. Biol., 9, (1999). TROSY - transverse relaxation optimized spectroscopy

71 Deuterowanie i TROSY Widma HSQC (a) i TROSY (b) 15 N, 2 H- gyrazy-45 ze Staphylococcus aureus (45 kDa). G. Wider, K. Wüthrich, Curr. Opin. Struct. Biol., 9, (1999).

72 Oddziaływanie białek z małymi ligandami trNOE, trRDC. Dynamika cząsteczkowa magnetyczna relaksacja jądrowa, wymiana chemiczna. Kompleksy białkowe i oligomery filtrowanie izotopowe, techniki redagowania. Białka paramagnetyczne. Bałka membranowe techniki NMR ciała stałego. Zagadnienia dotyczące NMR białek, które nie zostały poruszone w wykładzie


Pobierz ppt "Metody NMR stosowane w badaniach biopolimerów Część 2: Badania strukturalne białek."

Podobne prezentacje


Reklamy Google