Spotkanie PBU zorganizowane przez Związek Pracodawców Przemysłu Utylizacyjnego Dziękuję bardzo za zaproszenie do uczestnictwa w Wiosennej Konferencji Programowej,

Prezentacja na temat: "Spotkanie PBU zorganizowane przez Związek Pracodawców Przemysłu Utylizacyjnego Dziękuję bardzo za zaproszenie do uczestnictwa w Wiosennej Konferencji Programowej,"— Zapis prezentacji:

1 Spotkanie PBU zorganizowane przez Związek Pracodawców Przemysłu Utylizacyjnego Dziękuję bardzo za zaproszenie do uczestnictwa w Wiosennej Konferencji Programowej, Warszawa, 13.04.2016 Bogusławice, 28.05,2014 Warszawa 16.12.2016

2 Wykrywanie i identyfikacja gatunkowa białek zwierzęcych nieprzetworzonych i przetworzonych Wiosenna Konferencja Programowa ZPPU Warszawa 13.04.2016 Krzysztof Kwiatek PAŃSTWOWY INSTYTUT WETERYNARYJNY - PAŃSTWOWY INSTYTUT BADAWCZY w Puławach 2

3 Zarys treści prezentacji  Wprowadzenie  Przepisy prawne w zakresie UPPZ i PP  Fałszowanie produktów w łańcuchu żywnościowym w zakresie składu gatunkowego białek zwierzęcych  Kontrola laboratoryjna gatunkowości białek zwierzęcych nieprzetworzonych i przetworzonych  Identyfikacja gatunkowa białek zwierzęcych  Wyniki badań gatunkowości mięsa  Wnioski 3

4 Zapewniamy bezpieczeństwo całego łańcucha żywnościowego i ochronę zdrowia publicznego w zakresie utylizacji UPPZ Produkcja pierwotna (gospodarstwo) Produkcja pierwotna (gospodarstwo) Produkcja żywności UPPZ Dystrybucja Przechowywanie żywności u konsumentów Moment konsumpcji Podejście to oznacza, że każdy etap łańcucha żywnościowego musi być uwzględniony w systemie zarządzania bezpieczeństwem UPPZ i PP Dobra Praktyka Utylizacyjna przede wszystkim, a potem HACCP UPPZ

5 5 Łańcuch powstawania UPPZ – na różnych etapach łańcucha żywnościowego powstają UPPZ

6 Przetworzone UPPZ staja się PP Produkty pochodne (PP) – produkty otrzymane w wyniku przynajmniej jednej obróbki, przekształcania lub przetwarzania UPPZ Produkty pochodne przetwarzanie Wytwarzanie UPPZ wszelkie produkty pochodzenia zwierzęcego jeżeli nie są przeznaczone do spożycia przez ludzi, uznawane będą za UPPZ. wg dr K. Bednarczyk)

7 Łańcuch żywnościowy – zarządzanie nie tylko zagrożeniami, ale i ryzykiem w zakresie UPPZ/PP – nowe podejście od 2004 roku Produkcja pierwotna (gospodarstw o) Produkcja pierwotna (gospodarstw o) Produkcja got. żywności Transport Dystrybucja Przechowywanie żywności u konsumentów Moment konsumpcji Łańcuch żywnościowy: koncentracja na bezpieczeństwie łańcucha. Włączamy UPPZ i PP do procesu analizy zagrożeń i analizy ryzyka, tworzymy i wdrażamy nowe regulacje prawne….. FSO PO PC PO ADI MRL, ML, NP ALOPALOP GAP/GBP/GVP/GMP/GHP/DPU HACCP Analiza ryzyka Analiza zagrożeń 7 TDI ML ZERO

8 Przepisy ogólne dotyczące UPPZ/PP  Rozporządzenie Parlamentu Europejskiego i Rady (WE) nr 1069/2009 z dnia 21 października 2009 r. określające przepisy sanitarne dotyczące produktów ubocznych pochodzenia zwierzęcego, nieprzeznaczonych do spożycia przez ludzi,i uchylające rozporządzenie (WE) nr 1774/2002 (rozporządzeni o produktach ubocznych pochodzenia zwierzęcego)  Rozporządzenie Komisji (UE) nr 142/2011z dnia 25 lutego 2011 r. w sprawie wykonania rozporządzenia Parlamentu Europejskiego i Rady (WE) nr 1069/2009 określającego przepisy sanitarne dotyczące produktów ubocznych pochodzenia zwierzęcego, nieprzeznaczonych do spożycia przez ludzi, oraz w sprawie wykonania dyrektywy Rady 97/78/WE w odniesieniu do niektórych próbek i przedmiotów zwolnionych z kontroli weterynaryjnych na granicach w myśl tej dyrektywy  ROZPORZĄDZENIE PARLAMENTU EUROPEJSKIEGO I RADY (WE) NR 999/2001 z dnia 22 maja 2001 r. ustanawiające zasady dotyczące zapobiegania, kontroli i zwalczania niektórych ► C1 pasażowalnych ◄ gąbczastych encefalopatii (Dz.U. L 147 z 31.5.2001, s. 1) z poźn.zm.)

9 UPPZ - kierunki zmian i rozwój badań  Wdrożenie wymagań w zakresie bezpiecznego postępowania UPPZ/PP zostało określone jako jeden z priorytetów EU w zakresie badań i wdrożeń prawa żywnościowego  Jednym z nich jest określanie kategorii i gatunkowości UPPZ i PP, aby eliminować kanibalizm i transmisję czynnika TSE (BSE) i innych czynników zagrożeń związanych np. z wykorzystaniem żywieniowym 9

10 ZAKAZ PASZOWY-OBECNA SYTUACJA I KOLEJNE KROKI w zakresie PAP TYLKO DLA NIEODSTAWIO NYCH OSESKÓW 01.07.2013 Walidacja i wdrożenie metody Real-Time PCR dla DNA przeżuwaczy Po walidacji metody Real-Time PCR (wp/dr)

11 Rozporządzenie Komisji (UE) 2016/27 z dnia 13 stycznia 2016 r. - eksport  zmieniające załączniki III i IV do rozporządzenia (WE) nr 999/2001 Parlamentu Europejskiego i Rady ustanawiającego zasady dotyczące zapobiegania, kontroli i zwalczania niektórych pasażowalnych encefalopatii gąbczastych  wywóz przetworzonego białka pochodzenia zwierzęcego oraz produktów zawierających takie białka  EXPORT MOŻE DOTYCZYĆ WYŁĄCZNIE PAP WYPRODUKOWANEGO Z TKANEK ZWIERZĄT INNYCH NIŻ PRZEŻUWACZE 11

12 Notyfikacje w RASFF dotyczące występowania białka przeżuwaczy (styczeń 2015 – luty 2016) 1/3 Data Typ powiadomie nia Zgłoszo ne przez: Kraje: (O) - pochodzenia, (D) - dystrybucji Notyfikacja 08/01/ 2015 InformacyjneGermanyGermany (O), Poland (D) too high content of zinc (841 mg/kg - ppm) in complete feed for piglets from Germany 19/01/ 2015 InformacyjneItalyBosnia and Herzegovina (D), Greece (D), Italy (D/O) presence of ruminant DNA in complete feed for trout from Italy 26/01/ 2015 InformacyjneBulgariaBulgaria (D), Germany (O), Netherlands presence of ruminant DNA in feed for fish from Germany, via the Netherlands 02/03/ 2015 AlertGermanyAustria (O), Commission Services, Germany (D) too high content of ragweed (Ambrosia spp.) seeds (61 mg/kg - ppm) in bird feed from Austria 10/03/ 2015 InformacyjneLatviaCommission Services, Estonia (D), Latvia (D), Poland (O) presence of ruminant DNA in complete feed for fish from Poland 24/03/ 2015 InformacyjneFinlandEstonia (D), Finland (D), Italy (O), Latvia (D) presence of ruminant DNA in fish meal from Italy 24/04/ 2015 InformacyjneCyprusCyprus (D), Germany (O), Italy (O), Spain (O) presence of ruminant DNA in fish feed manufactured in Italy, with raw material from Germany and Spain 09/06/ 2015 InformacyjneItalyBulgaria (D), Italy (D/O), Portugal (D/O), Spain (D/O) presence of ruminant DNA in complete feed for trout from Italy, with raw material from Spain and Portugal

13 Notyfikacje w RASFF dotyczące występowania białka przeżuwaczy (styczeń 2015 – luty 2016) 3/3 Data Typ powiadomie nia Zgłoszo ne przez: Kraje: (O) - pochodzenia, (D) - dystrybucji Notyfikacja 03/08/2 015 InformacyjneGermanyAustria, Commission Services, Germany (D), Poland (D/O) cadmium (6.66 mg/kg - ppm) in complete feed for dogs from Poland 10/08/2 015 InformacyjneItalyGermany (O), Italy (D/O), Pakistan, Portugal (O), Spain (O) presence of ruminant DNA in complete feed for trouts from Italy, with raw material from Germany, Spain and Portugal 07/09/2 015 InformacyjneCyprusCyprus (D), Italy (D/O), Spain (D) presence of ruminant DNA in feed for seabream/dorada from Italy, via Spain 11/09/2 015 InformacyjneItalyCommission Services, Italy (D), Spain (O) presence of ruminant DNA in fish feed for trout from Spain 12/11/2 015 InformacyjneSpainPortugal (D), Spain (O) presence of ruminant DNA in fish feed from Spain 01/12/2 015 InformacyjneBelgiumBelgium, Brazil (D/O), India (D), Portugal (D) dioxins (5.42 pg WHO TEQ/g) in complementary feed for fish from Brazil 04/12/2 015 InformacyjneBelgiumBelgium (D), Denmark (D), France (O), Germany (D), Iceland (D), Ireland (D), United Kingdom (D) lead (145 mg/kg - ppm) in mineral feed for sheep and goats from France 18/01/2 016 InformacyjneDenmarkCzech (D), Denmark (D), France (D), Iceland (O), Lithuania (D), Netherlands (D), Norway (D), Poland (D), Sweden (D), UK (D) mercury (0.88; 1.03; 0.97 mg/kg - ppm) in petfood (fish snack) from Iceland

14 Wymagane jest prowadzenie kontroli urzędowej w zakresie zafałszowań:  potwierdzania autentyczności rodzajowej i gatunkowej produktu, jak również wykrywanie zafałszowań.  badanie tożsamości w kontekście nazwy, pod jaką jest produkt oferowany i weryfikacja składu podanego na opakowaniu ze stanem faktycznym, stanowi podstawę zapewnienia właściwej jakości produktów łańcucha żywnościowego Rozporządzenie Parlamentu Europejskiego i Rady (WE) nr 882/2004

15 Aspekty laboratoryjne zapewnienie bezpieczeństwa UPPZ i PP  Stała kontrola laboratoryjna UPPZ i PP w zakresie obecności substancji szkodliwych biologicznych i chemicznych (czynników zagrożeń) prowadzona jest od dawna i rozwijana  Opracowywanie i wdrażanie metod wykrywania i identyfikacja UPPZ i produktów pochodnych w środowisku, paszach, karmach, a nawet żywności – nowe zagadnienie od 20 lat  Identyfikacja gatunkowa UPPZ i PP – zagadnienie nowe od 7-10 lat

16 PUKP na 2016 rok - Zakres laboratoryjnych badań urzędowych pasz w zakresie parametrów bezpieczeństwa obejmuje gatunkowość Pobierane są próbki pasz do badań laboratoryjnych monitoringowych w kierunku następujących kierunkach : obecności przetworzonego białka zwierzęcego, Identyfikacja gatunkowa produktów z krwi metodą PCR Identyfikacja gatunkowa białka przeżuwaczy metodą PCR w karmach dla ryb Określanie masy cząsteczkowej hydrolizowanego białka w materiałach paszowych

17 Aktualne problemy metodyczne w wykrywaniu i identyfikacji białek zwierzęcych  Dostępność i wiarygodność metod badania zafałszowań w zakresie wykrywania i identyfikacji gatunkowej białek zwierzęcych w UPPZ i PP  Określania ich poziomu w badanym produkcie 17

18 Zafałszowania UPPZ i PP  Materiały kat. 3 – dodatek UPPZ z przeżuwaczy  Do mączek rybnych dodatek- MBM, PAP  Dodatek do PAP - MBM kat. 2, NO/PG  Dodatek do PAP – PP z przeżuwaczy  Pasze dla ryb – PP z przeżuwaczy  Produkty z krwi – PP z przeżuwaczy 18

19  Sprawdzenie, czy oferowany surowiec/produkt nie jest zafałszowany  Czy do surowców/produktów nie wprowadza się zmian, których celem jest ukrycie rzeczywistego ich składu?  Czy są stosowane nazwy rodzajowe adekwatne do surowców i zastosowanych procesów technologicznych (PAP/MMK) Zakres prowadzonych kontroli urzędowych i producenckich w zakresie UPPZ/PP

20 1.Metody badań organoleptycznych (za pomocą naszych zmysłów) 2.Metody serologiczne (immunologiczne, immunoenzymatyczne): ELISA, FAST 3.Metody oparte na analizie białek (izoogniskowanie elektroforetyczne (IEF, SDS-PAGE) 4.Metody oparte na analizie DNA (PCR, RT-PCR) 5.Metody chemiczne Metody identyfikacji gatunkowej UPPZ, PP, mięsa i jego przetworów

21  Metody serologiczne (immunologiczne, immunoenzymatyczne) polegają na tworzeniu się kompleksów antygen- przeciwciało między wyekstrahowanymi białkami mięsa, a specyficznymi przeciwciałami - dyfuzyjne testy precypitacyjne wg Outcherlony (Orbit, Prime, Profit, próba pierścieniowa) - ELISA - F.A.S.T. Metody serologiczne

22 Testy precypitacyjne (Profit, Prime, Orbit) 22

23 Wady i zalety metody serologicznej  Łatwość wykonania  Czas badania krótki - 24h  Poziom wykrywalności - od 2%  Ograniczone zastosowanie – materiały, mięso surowe i produkty mięsne surowe  Brak możliwości badania np. podrobów/inne białka niż w tkance mięśniowej

24 Test ELISA w badania gatunkowości  W testach typu ELISA używane są swoiste przeciwciała skierowane przeciwko białkom charakterystycznym dla poszczególnych gatunków zwierząt.  Białka pozyskane z badanych próbek surowego mięsa w postaci odpowiednich ekstraktów zostają związane z przeciwciałami tworząc kompleksy wykrywane przy użyciu znakowanych enzymem przeciwciał.  Test ELISA umożliwia identyfikację gatunkową mięsa w próbkach jednego gatunku, jak również w próbkach stanowiących mieszankę mięsa kilku gatunków zwierząt. 24

25 Test ELISA w badaniu gatunkowości  Zaletą testów ELISA jest możliwość wykonywania w standardowych warunkach laboratoriów diagnostycznych, krótki czas badania, możliwość jednoczesnej analizy znacznej liczby próbek oraz stosunkowo wysoka łatwość odczytu i interpretacji wyników.  Za mankament metody uważa się możliwość wystąpienia reakcji krzyżowych w przypadku badania próbek pochodzących od blisko spokrewnionych gatunków zwierząt rzeźnych.  Należy zwrócić uwagę na różnice w intensywności reakcji barwnej, a tym samym ocenę wyniku. Dostępne są też Testy ELISA dla mięsa obrobionego termicznie (Czułość 1.0% dla produktów gotowanych i typu konserwy sterylizowane) 25

26  Test F.A.S.T. – modyfikacja testu ELISA  Antygeny z próbki zostają związane z przeciwciałami opłaszczonymi na mieszadełkach.  Kompleksy A+P wiążą się z przeciwciałami znakowanymi enzymem, następnie z substratem,  w wyniku tego powstaje produkt barwny, co prowadzi do zmiany koloru roztworu. Test FAST do identyfikacji gatunkowej

27 Test FAST -Sposób postępowania Próbka laboratoryjna 10 g + 100 ml wody dest. Rozdzielenie warstw w cylindrze Przeniesienie supernatantu do probówek z przeciwciałami Przeniesienie supernatantu do probówek z mieszadełkami Przeniesienie supernatantu do probówek z substratem Próbka pierwotna 250 g

28  polega na rozdziale substancji białkowych posiadających ładunek elektryczny;  rozdział zachodzi w żelu, który charakteryzuje się gradientem pH, w którym białka wędrują do punktu izoelektrycznego, (pI),  ma zastosowanie do badania mięsa surowego zwierząt rzeźnych,  umożliwia także różnicowanie gatunkowe dziczyzny Metoda izoogniskowania elektroforetycznego (IEF) w gradiencie pH

29 METODA IEF Oznaczane gatunki: -zwierzęta dzikie: sarna jeleń łoś zając bóbr jenot dzik -zwierzęta domowe wołowina wieprzowina konina drób

30 METODA IZOOGNISKOWANIA (IEF) 1.m. wołowe 2.próbka – m. wołowe 3.próbka – m. wołowe 4.próbka – m. wołowe 5.m. końskie 6.próbka – m. wołowe 7.próbka – m. wołowe 8.m. wieprzowe

31 SDS-PAGE w identyfikacji gatunkowej  Elektroforeza białek w żelu poliakrylamidowym w obecności SDS  elektroforeza w żelu poliakrylamidowym jest techniką powszechnie stosowaną w analizie białek.  W zależności od zastosowanego układu można uzyskać rozdział polipeptydów stosownie do różnych właściwości fizykochemicznych.  Przyjmuje się, że elektroforeza w obecności SDS frakcjonuje białka zależnie od ich masy (długości łańcucha polipeptydowego).

32  Analiza DNA (PCR) polega na replikacji specyficznych sekwencji DNA przy udziale polimerazy, a następnie – wykorzystując metody elektroforezy lub rejestr sygnału – analizie poddaje się namnożone repliki DNA,  DNA mitochondrialne - większa specyficzność  ma zastosowanie do badania surowców pochodzenia zwierzęcego, mięsa surowego oraz produktów mięsa poddanego obróbce cieplnej. Technika PCR w identyfikacji gatunkowej białek zwierzęcych

33 Stosowane metody/techniki określania gatunkowości białek zwierzęcych  Do wykrywania i identyfikacji gatunkowej białek zwierzęcych obecnie praktyczne zastosowanie ma technika PCR w dwóch odmianach, a mianowicie: konwencjonalnym PCR i Real-Time PCR (PCR w czasie rzeczywistym – RT-PCR).  W PIWet-PIB w Puławach do wykrywania i identyfikacji gatunkowej białek zwierzęcych wykorzystywane są obie techniki, które opisane są w postaci procedur badawczych. 33

34 Klasyczny PCR w identyfikacji gatunkowej  Umożliwia wykrycie i identyfikację gatunkową mięsa i produktów mięsnych, UPPZ, PP  Matryca surowa i poddana obróbce termicznej (np. wieprzowa, wołowa, drobiowa)  LOD – 0,05 - 0,2% co pokazano na następnym slajdzie 34

35 GRANICA WYKRYWALNOŚCI DNA białka wołowego M P N Nd Nwp 0,05 0,1 0,2 0,5 1 2 5 M P N Nw Nwp 0,05 0,1 0,2 0,5 1 2 5 10 DNA białka drobiowego M P N Nw Nd 0,05 0,1 0,2 0,5 1 2 5 M DNA białka wieprzowego

36 CECHY CHARAKTERYSTYCZNE METODY PCR DNA przeżuwac zy DNA wołowe DNA owcze DNA wieprzo we DNA drobiow e Dokładność98,993,8%97,8%97,5%92,5% Czułość98,6%91,7%97,1%96,7%90% Specyficzność100% Granica wykrywalności 0,05% 0,1%0,2%

37 Technika konwencjonalnego PCR  Procedura badawcza ZHS/PB-19 „Wykrywanie i identyfikacja gatunkowa DNA białka zwierzęcego z zastosowaniem techniki PCR”. Wyd. 6, z dn. 25.05.2015 r. (A)  Poziom wykrywalności metody opisanej w tej procedurze wynosi: dla białka wołowego – 0,05%, dla białka wieprzowego – 0,1% i dla białka drobiowego - 0,2%.  Metoda klasycznego PCR jest typową metodą jakościową.  Metoda jest akredytowana od 2014 roku. 37

38 Technika Real-Time PCR  Umożliwia wykrycie, identyfikację gatunkową materiałów zwierzęcych np. mięsa, produktów mięsnych, UPPZ, PP oraz gatunkowe oznaczenie ilościowe  Matryca surowa i poddana obróbce termicznej (np. wieprzowa, wołowa, drobiowa, przeżuwacze) 38

39 Tok postępowania badawczego RT-PCR Metoda real-time PCR do identyfikacji gatunkowej DNA przeżuwaczy w surowcach zwierzęcych (np. UPPZ) i produktach przetworzonego białka zwierzęcego (PP) polega na: Amplifikacji fragmentów mitochondrialnego DNA zawierających specyficzne gatunkowo dla genomu przeżuwaczy sekwencje nukleotydowe. Reakcja należy do metod specyficznych gatunkowo wykorzystujących system sond TaqMan i jest zoptymalizowana dla aparatów płytkowych ABI. Analiza obejmuje dwa etapy: izolację DNA i reakcję real-time PCR. Do analizy wykorzystywane jest DNA mitochondrialne. Do izolacji DNA z PP wykorzystywany jest test komercyjny Wizard Magnetic DNA Purification System for Food (Promega). W przypadku badania surowych materiałów kategorii 3 do izolacji DNA ma zastosowanie test Genomic Mini AX Food (A&A Biotechnology). Pozostałe parametry metody pozostają niezmienione. 39

40 Rtpcr Wytyczne EURL-AP dla RT-PCR  Rozporządzenie Komisji nr 51/2013 z dnia 16 stycznia 2013 r. oraz procedurze przekazanej przez EURL-AP „EURL-AP Standard Operating Procedure Detection of ruminant DNA in feed using real-time PCR”.  Metoda oparta na technice Real-Time jest metodą referencyjną w świetle wytycznych Komisji Europejskiej i EURL-AP.  Metoda ta została poddana ocenie akredytacyjnej PCA w dniach 25-26.05.2015 roku i uzyskała akredytację. 40

41 Metoda RT-PCR do wykrywania DNA przeżuwaczy Obecnie metoda Real-Time PCR służy do wykrywania DNA przeżuwaczy zalecana przez Europejskie Laboratorium Referencyjne do badania mączek rybnych i pasz przeznaczonych dla ryb hodowlanych, produktów krwi, ……..pasz…..

42 RT-PCR (PCR w czasie rzeczywistym) Procedura badawcza ZHS/PB-31 „Wykrywanie i identyfikacja gatunkowa DNA białka zwierzęcego z zastosowaniem techniki Real-Time PCR”, Wyd. 4, z dn. 25.05.2015 r. (A), Stosowana do identyfikacji DNA białka przeżuwaczy w paszach i DNA białka końskiego w mięsie.  LOD – 0,05% (DNA przeżuwaczy), 0,1% (DNA końskie)  LOQ – 0,001%(DNA końskie) 42

43 CECHY CHARAKTERYSTYCZNE METODY REAL-TIME PCR DNA przeżuwaczyDNA końskie Dokładność (AC)98,8%97,5% Czułość (SE)98,3%96,7% Specyficzność (SP) 100% Granica wykrywalności 0,05%0,1%

44 AKTUALNE PRACE BADAWCZE  W 2015 r. walidacja metody Real-Time PCR wykrywania DNA białka wieprzowego. W grudniu 2015 przekazano procedurę badawczą EURL-AP. Rozpoczęto badania ILC w 2016 roku. Wyniki ILC w opracowaniu  W 2016 r. (2017) walidacja metody Real-Time PCR wykrywania DNA białka drobiowego

45 REAL-TIME PCR DLA KONINY  Metoda opracowana przez EURL-AP – wykrywanie i oznaczanie Wykrywanie i oznaczanie zawartości koniny (kit)  Test komercyjny First-Horse PCR Kit (GEN-IAL)  Test komercyjny First-Meat PCR Kit (GEN-IAL)

46 Real-time PCR – opis rezultatów badań dla próbki pozytywnej i negatywnej O wyniku reakcji decyduje obserwacja, czy zachodzi wzrost fluorescencji. Obserwowany dla próbek pozytywnych wzrost fluorescencji uwidacznia się w postaci charakt. krzywej. Dla próbek negatywnych zjawisko takie nie zachodzi.

47 Real-time PCR – opis rezultatów badań dla próbki pozytywnej i negatywnej Typowe krzywe fluorescencji dla serii próbek pozytywnych. Linia czerwona – linia odcięcia, opisująca punkty Ct przypisane dla poszczególnych próbek. Im więcej analitu - tym wyższe Ct, reakcja zachodzi szybciej i intensywniej – szybszy wzrost fluorescencji. Ct daje więc przybliżoną informacje o ilości analitu w próbce. Ma szczególne znaczenie w ilościowej ocenie zawartości na podstawie krzywych kalibracyjnych.

48 Real-time PCR – opis rezultatów badań dla próbki pozytywnej i negatywnej Przedstawiona seria sześciu rozcieńczeń DNA materiału odniesienia o znanej zawartości analitu pozwala na wykreślenie krzywej kalibracyjnej dla tego analitu. Badane próbki powinny charakteryzować się punktami Ct w zakresie krzywej kalibracyjnej.

49 Real-time PCR – opis rezultatów badań dla próbki pozytywnej i negatywnej Typowa krzywa kalibracyjna ilustrująca zależność poszczególnych zawartości analitu (standardy o znanej zawartości) względem przypisanych im punktom Ct. Na podstawie Ct próbek o nieznanej zawartości analitu z krzywej otrzymujemy odczyt zawartości amplifikowanej sekwencji DNA. Ilościowe oznaczanie zawartości koniny w mięsie ogółem szacowane jest na podstawie dwóch krzywych kalibracyjnych dla koniny i białka zwierzęcego. Porównanie ilości DNA końskiego i DNA zwierzęcego wskazuje ilość koniny w próbce mięsa.

50 Czym dysponujemy - metodyki  ZHS/PB-31. Obecność i identyfikacja gatunkowa DNA białka zwierzęcego. Metoda real-time PCR.(jakościowa, konina, wołowina, przeżuwacze)  ZHS/PB-25. Obecność i identyfikacja gatunkowa. Metoda real-time PCR (ilościowa, konina).  ZHS/PB-23. Obecność specyficznych gatunkowo białek zwierząt. Metoda elektroforetyczna, jakościowa (zwierzęta łowne i gospodarskie)  ZHS/PB-21. Obecność specyficznych gatunkowo białek (świni, bydła i drobiu). Metoda ELISA (FAST).  ZHS/PB-19. Obecność i identyfikacja gatunkowa DNA białka zwierzęcego. Metoda PCR. (3 gatunki wykrywanie) 50

51 51 RODZAJ PRÓBEK Liczba próbek zbadanych techniką IEF Liczba próbek zbadanych techniką PCR Liczba próbek zbadanych techniką RT-PCR WIEPRZOWINA -32- WOŁOWINA -99 w kierunku KONINY -- 588 (51+) (2013-2015) DROBIOWE -2- ZWIERZYNA ŁOWNA 172-- Wyniki badań gatunkowości mięsa technikami: IEF, PCR i Real Time -PCR w ZHS PIWet-PIB w latach 2014 – 2015

52 52 RODZAJ PRÓBEK MIĘSA LICZBA ZBADANYCH PRÓBEK PRÓBKI NIEZGODNE WIEPRZOWE 2707 (2,60%) WOLOWE 164 (25,0%) DROBIOWE 81 (12,5%) ZESTAWIENIE WYNIK Ó W BADAŃ TESTEM F.A.S.T (2012-2015)

53 Liczba próbek zbadanych Próbki ujemne/ odsetek Próbki podejrzane/ odsetek Próbki dodatnie > 1% Próbki zawierające < 1% poziom dopuszczalny 534496 (92,88%) 38 (7,12%) 26 (4,86%) Zakres 1,17-100,0 12 (2,24%) Zakres 0,4-0,001 Wyniki badań próbek trimingu wołowego w kierunku zafałszowania koniną, pobranych przez IW, badanych w PIWet-PIB w Puławach wg stanu na dzień 20.05.2013

54 Określanie gatunkowości PAP w paszach dla zwierząt akwakultury  Badanie PCR (3 gatunki) – metoda akredytowana  Badanie RT-PCR (1 gatunek) – metoda akredytowana  W 2016 w PUKP – 64 próbki (monitoring)+ badania urzędowe 54

55 Określanie gatunkowości produktów z krwi – od 2015  Badanie PCR (3 gatunki) – metoda akredytowana  Badanie RT-PCR (1 gatunek) – metoda akredytowana  W 2016 w PUKP – 160 próbek (monitoring)+ badania urzędowe 55

56 WYNIKI BADANIA PASZ METODĄ PCR W KIERUNKU IDENTYFIKACJI GAT. W 2015 ROKU Rodzaj próbekLiczba próbek Liczba próbek zawierających DNA białka przeżuwaczy /wołowego Liczba próbek zawierających DNA białka drobiowego Liczba próbek zawierających DNA białka wieprzowego Materiały paszowe Mączka rybna122 (16,67%)0 (0%)12(16,67%) Produkty z krwi1789 (5,06%)3 (1,69%)58 (32,58%) inne6000 Mączka mięsno- kostna 554 (7,27%) 5 (9,09%) Mieszanki paszowe 449 (20,45%)4 (9,09%)13 (29,55%) dla ryb214 (19,05%) 6 (28,57%) Razem318

57 METODA MIKROSKOPOWA A PCR ProduktDozwolony do stosowania Wykrywanie metodą mikroskopowe j Wykrywanie metodą PCR SERWATKA  MLEKO W PROSZKU  PLAZMA SUSZONA WIEPRZOWA  PLAZMA SUSZONA WOŁOWA  TŁUSZCZ WIEPRZOWY  TŁUSZCZ WOŁOWY  PRODUKTY Z JAJ 

58 METODA MIKROSKOPOWA A PCR ProduktDozwolony do stosowania Wykrywanie metodą mikroskopo wej Wykrywanie metodą PCR SKŁADNIKI KOLAGENOWE WIEPRZOWE  SKŁADNIKI KOLAGENOWE WOŁOWE  PRODUKTY Z KRWI WIEPRZOWE PRODUKTY Z KRWI WOŁOWE 

59 WNIOSKI  Zapewnienie autentyczność gatunkowej UPPZ i produktów pochodnych wymaga opracowania i wdrożenia metod laboratoryjnej kontroli  Spośród szeregu metod identyfikacji gatunkowej i oznaczania technika Real-Time PCR wydaje się być możliwą do szerszego zastosowania w jakościowej i ilościowej analizie gatunkowości UPPZ i PP  Technika (metoda) Real–Time PCR pozwala na wykrywanie zafałszowań produktu niepożądanym gatunkiem białka zwierzęcego na bardzo niskim poziomie

60

61 61