Metody NMR stosowane w badaniach biopolimerów Część 4: Badania strukturalne oligosacharydów

Zastosowanie spektroskopii NMR w badaniach oligosacharydów. Podstawowe definicje Budowa monosacharydów Struktura pierścieniowa i mutarotacja Wiązanie glikozydowe Glukoza i cyklodekstryny Laktoza Sacharoza Fukozylolaktozy Pentasacharyd mleka ludzkiego Faktor IX surowicy krwi ludzkiej

Definicje Sacharydy - związki zbudowanie z węgla, tlenu i wodoru. Ich inna nazwa - węglowodany - nawiązuje do wzoru sumarycznego Cm(H2O)n, który jednak nie zawsze jest prawdziwy. Zawierają liczne grupy hydroksylowe (-OH) oraz mogą zawierać szereg innych grup funkcyjnych. Forma łańcuchowa zawsze posiada grupę karbonylową (-CO-) lub aldehydową (-CHO); ketozy i aldozy. Monosacharydy - pojedyncza jednostka cukrowa. Oligosacharydy - niewielka liczba (zwykle 2 - 10) reszt monosacharydowych połączonych wiązaniami glikozydowymi. Polisacharydy - makrocząsteczki, w których bardzo duża liczba reszt monosacharydowych jest połączona wiązaniami glikozydowymi. Oligo- i polisacharydy mogą być: liniowe, rozgałęzione lub cykliczne.

Dlaczego oligosacharydy są ważne dla biologa ? Oligosacharydy organizmach występują samodzielnie oraz w połączeniu z białkami (glikoproteiny) i tłuszczami (glikolipidy). Glikoproteiny - najliczniejsze białka złożone występują w osoczu krwi, erytrocytach, błonach komórkowych, tkankach łącznych, wydzielinach śluzowych, hormonach. Glikolipidy występują w błonach komórkowych

Monosacharydy - budowa triozy - 3 atomy węgla, tetrozy - 4 atomy węgla, pentozy - 5 atomów węgla, heksozy - 6 atomów węgla. Większość biologicznie ważnych monosacharydów ma 5 lub 6 atomów węgla.

Postać łańcuchowa monosacharydów Postać łańcuchowa monosacharydów Przykład - dwie aldotetrozy: erytroza i treoza. Dwa asymetryczne (*) atomy węgla powodują pojawienie się czterech stereoizomerów. Dla pentoz istnieje 23 = 8 Dla heksoz istnieje 24 = 16 1 Przykład - dwie aldotetrozy: erytroza i treoza. Dwa asymetryczne (*) atomy węgla powodują pojawienie się czterech stereoizomerów. Dla pentoz istnieje 23 = 8 Dla heksoz istnieje 24 = 16 2 3 4 enancjomery D erytrozy L enancjomery D treozy L

a-D-erytrofuranoza D-erytroza b-D-erytrofuranoza a-D-treofuranoza Równowaga jest silnie przesunięta w stronę formy cyklicznej. Pojawiają się dwa kolejne diasteroizomery. a-D-erytrofuranoza D-erytroza b-D-erytrofuranoza a-D-treofuranoza D-treoza b-D-treofuranoza

Postać cykliczna monosacharydów Przy cyklizacji powstaje kolejny asymetryczny atom węgla C1 zwany anomerycznym. Konfiguracja węgla anomerycznego jest oznaczana a lub b. Cukry tworzące pierścienie pięcioczłonowe - furanozy, Cukry tworzące pierścienie sześcioczłonowe - piranozy. Znaczenie biologiczne mają D-monosacharydy. Nieliczne wyjątki dotyczą form L jedynie kilku monosacharydów (L-Fuc, L-Glu, L-Gal,…) a-D a-L piranozy 6 b-L b-D 4 1

W roztworze zawsze istnieje równowaga pomiędzy stereoizomerami a i b Mutarotacja, to przejście a  b przez formę łańcuchową. Np. dla glukozy a: 36% b: 64%

Definicja kątów torsyjnych  i  określających konformację wiązania glikozydowego na przykładzie disacharydu b-laktozy. b-D-Galp(14)b-D-Glcp Galb(14)Glcb : H1–C1–O1–C4’ : C1–O1–C4’–H4’ NOE: H1…H4’ 3J(H1,C4’) 3J(C1,H4’) Jeden ze sposobów określania konformacji wiązania glikozydowego.

Polisacharydy Celuloza: 4)Glc(b14)Glc(b1 łańcuch nierozgałęziony Glikogen: 4)Glc(a14)Glc(a1 oraz Glc(a16)Glca łańcuch rozgałęziony Chityna: 4)GlcNAc(b14)GlcNAc(b1 Amyloza: 4)Glc(a14)Glc(a1 Amylopektyna: jak glikogen Skrobia: ~25% amylozy i ~ 75% amylopektyny.

Oligosacharydy – zagadnienia rozwiązywalne przy pomocy NMR CO Liczba i typ składników oligosacharydów Połączenia cukrów w oligosacharydach Konfiguracja anomerycznych atomów węgla Konformacja wiązań glikozydowych JAK Przypisania sygnałów w widmach NMR Informacje strukturalne z przesunięć chemicznych, stałych sprzężenia spinowego i NOE

Przesunięcia chemiczne 13C węgli anomerycznych Glca(14)Glca,b (a-92.8, b-96.8); maltoza 100.7 Glcb(14)Glca,b (a-92.9, b-96.8); celobioza 103.6 Sprzężenia spinowe 3J(H1,H2) w piranozach identyfikacja anomeru a-anomer: (Glc, Gal, Fuc) J~2 – 4 Hz, (Man) J~1.6 Hz b-anomer: (Glc, Gal, Fuc) J~7 – 9 Hz, (Man) J~0.8 Hz

Celobioza i maltoza (disacharydy) – 13C NMR maltoza: Glca(1→4)Glca,b celobioza: Glcb(1→4)Glca,b celobioza maltoza

Przesunięcia chemiczne 1H - efekt podstawienia a-Glc, 4)-[aGlc]6-(1 , 4)-[aGlc]10-(1 3J(H1,H2)=3,6 Hz Typowe wartości 3J(H1,H2) dla anomerów a tych monosacharydów, w których H2 jest aksjalny. 3J(H1,H2)=3,4 Hz

Laktoza w DMSO; widoczne są protony OH. b-D-Galp(14)[a,b]-D-Glcp II I 6.0 5.0 4.0 3.0 I1a I1b II1b Glca: 3J(H1,H2) = 4,1 Hz Glcb: 3J(H1,H2) = 7,3 Hz Galb: 3J(H1,H2) = 7,5 Hz prosta metoda odróżniania anomerów. Kąty dwuścienne: dla Hax–C–C–Hax =180 dla Hax–C–C–Heq =60 zależność Karplusa.

Laktoza w DMSO b-D-Galp(14)[a,b]-D-Glcp II I Korelacja 1H/13C 3.5 3.0 II4a,b I5a 70 II2a,b I3a I2a b-D-Galp(14)[a,b]-D-Glcp II I II3a,b I5b I2b 75 I3b II5a,b Korelacja 1H/13C bez H1 i H6. 80 I4a,b 3.6 3.4 3.2 3.0

Disacharyd sacharoza aGlcp(12)bFruf Brak sygnału korelacyjnego 6 1 6 2 10,0 9,3 1 3,7 10,0 3,6 Hz 9,2 G6 F1 F6 G4 Brak sygnału korelacyjnego dla F2, ponieważ C2(Fru) jest czwartorzędowy. F4 G2 G5 G3 F3 F5 G1 Odczynnik: Cukrownia Dobrzelin, kampania 2006. Widma NMR: Katarzyna Ruszczyńska-Bartnik.

Galb(1→4)[Fuca(1→3)]Glca,b 1H NMR w DMSO selektywne 1D TOCSY Fukozylolaktoza: Galb(1→4)[Fuca(1→3)]Glca,b 1H NMR w DMSO selektywne 1D TOCSY Glcb całe widmo

Galb(1→4)[Fuca(1→3)]Glca,b 1H NMR w DMSO selektywne 1D TOCSY Fukozylolaktoza: Galb(1→4)[Fuca(1→3)]Glca,b 1H NMR w DMSO selektywne 1D TOCSY Częściowe widma fukoz – pobudzenie IV H1 Glca Glcb

Difukozylolaktoza: Fuca(1→2)Galb(1→4)[Fuca(1→3)]Glca,b 13C NMR w DMSO

Pentasacharyd wyizolowany z mleka ludzkiego Galb(1→4)[Fuca(1→3)]GlcNAcb(1→3) Galb(1→4)Glc-ol IV V III II I Widmo ROESY J. Dąbrowski, A. Ejchart, R. Brunz, H. Egge, FEBS Lett., 1989, 246, 229.

Przypisania - TOCSY Sekwencja - ROESY Gliko-nonapeptyd, Faktor IX surowicy krwi ludzkiej. Przypisania - TOCSY Sekwencja - ROESY R.J. Harris, H. van Halbeek, J. Glushka, L.J. Basa, V.T. Ling, K.J. Smith, M.W. Spellman, Biochemistry, 1993, 32, 6539. Neu5Aca(26)Galb(14)GlcNAcb(13)Fuca(1O)Ser61