Metody badań strukturalnych w biotechnologii

Prezentacja na temat: "Metody badań strukturalnych w biotechnologii"— Zapis prezentacji:

1 Metody badań strukturalnych w biotechnologii
Wykład VI Spektroskopia NMR – techniki dwuwymiarowe

2 Widmo 1H NMR aktyny – białka zbudowanego z 375 reszt aminokwasowych

3 W przypadku większych układów i makromolekuł widma jednowymiarowe nie dostarczają dostatecznych informacji – konieczne staje się zastosowanie technik dwuwymiarowych. Generalnie widma tego typu bazują na dwóch typach oddziaływań: - sprzężenie skalarne – przez wiązanie – badanie struktury, - sprzężenie dipolowe – przez przestrzeń – badania konformacyjne.

4 Wielowymiarowy NMR 2D 3D 1D MW ~ 300 MW ~ 10000 MW ~ 30000

5

6 Schemat eksperymentu jednowymiarowego:

7 Eksperyment dwuwymiarowy

8 W rezultacie otrzymujemy:

9

10 Najpopularniejsze eksperymenty dwuwymiarowe
Rodzaj badanych oddziaływań zastosowanie COSY COrrelated SpectroscoPY Homojądrowe sprzężenie spin-spin Analiza sprzężonych ze sobą atomów DQF COSY Double Quantum Filtered COSY Analiza sprzężonych ze sobą atomów, Pomiar stałych sprzężenia TOCSY TOtal Correlation SpectroscopY Korelowanie ze sobą całych układów spinowych

11 Heteronuclear Multiple Quantum coherence
HMQC Heteronuclear Multiple Quantum coherence Heterojądrowe sprzężenia spin-spin Korelacja przesunięć chemicznych protonów i heteroatomòw związanych przez jedno wiązanie HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation Korelacja przesunięć chemicznych protonów i heteroatomòw związanych przez kilka wiązań COSY-LR Longrange Correlated SpectroscopY Analiza sprzężeń dalekiego zasięgu

12 Nuclear Overhauser Effect SpectroscopY
NOESY Nuclear Overhauser Effect SpectroscopY Homojądrowe oddziaływania dipolowe Wyznaczanie odległości pomiędzy atomami ROESY Rotating Frame NOESY Wyznaczanie odległości pomiędzy atomami, stosowane w badaniach makromolekul

13 W badaniach strukturalnych największe znaczenie mają eksperymenty bazujące na sprzężeniach skalarnych – poprzez wiązania. Na podstawie analizy otrzymanych w ten sposób rezultatów możliwe jest przypisanie sygnałòw na widmie a co za tym idzie określenie struktury. A oto kilka przykładów

14

15

16 Widmo HHCOSY β-butyrolaktonu

17 Widmo HHCOSY kodeiny H-5 —> H-3 —> H-10 —> OH H-10 -> H-9 H-3 —> H-16 H-16 —> H-11

18 Spektroskopia 13 C NMR Metoda ta rozwinęła się stosunkowo niedawno – podstawowe przeszkody we wcześniejszym wykorzystaniu tej techniki stanowiły: - natruralna abundancja izotopu 13C wynosi zaledwie 1.1%, - czterokrotnie mniejsze odstępy poziomów spinowych (w porównaniu do 1H), co w rezultacie daje znacznie mniejszą intensywność sygnałów

19 Pełne wykorzystanie faktu zjawiska węglowego rezonansu jądrowego umożliwiły:
- ulepszenie metodyki i aparatury – wprowadzenie rejestracji widm metodą impulsową z transformacją Fouriera, - wykonywanie widm z rozprzęganiem jąder 13C - brak multipletowości na widmie powoduje zwiekszęnie intensywności sygnałów. W przypadku spektroskopii podstawowym kryterium analizy widm jest przesunięcie chemiczne.

20 Zakresy przesunięć chemicznych na widmach 13C NMR

21 Widmo 1H i 13C NMR β-butyrolaktonu

22 Widmo CHCOSY β-butyrolaktonu

23 Widmo HHCOSY i CHCOSY 1-butanolu

24 Widmo CHCOSY modyfikowanego glutationu

25

26 Widmo HH COSY

27 HMQC – Heteronuclear Multiple Quantum Coherence
Korelacja przesunięć chemicznych protonów związanych z jądrem X przez jedno wiązanie

28 HMBC – Heteronuclear Multiple Bond Correlation
Korelacja przesunięć chemicznych protonów związanych z X przez kilka wiązań

29 HMQC – Heteronuclear Multiple Quantum Coherence

30 HMBC – Heteronuclear Multiple Bond Correlation

31 Widmo HHCOSY i TOCSY reszty aminokwasowej:

32 2002 – nagroda Nobla z dziedziny chemii - Kurt Wüthrich – pokazał, że strukturę białek
można badać za pomocą NMR

33 Widmo NMR białka

34 NOESY TOCSY

35 Widmo NOESY białka

36

37 Oddziaływania obserwowane na widmie NOESY

38 Spektroskopia NMR Przypisanie sygnałów Intensywność Sygnałów NOE
Sprzężenia obliczenia dynamiki molekularnej

39