Metody NMR stosowane w badaniach biopolimerów

Prezentacja na temat: "Metody NMR stosowane w badaniach biopolimerów"— Zapis prezentacji:

1 Metody NMR stosowane w badaniach biopolimerów
Część 3: Badania strukturalne oligonukleotydów

2 Budowa kwasów nukleinowych – schemat ogólny
zasada azotowa zasada azotowa zasada azotowa 5' cukier 3' fosforan 5' cukier 3' fosforan 5' cukier 3' 5' koniec 3' koniec

3 Budowa kwasów nukleinowych
część cukrowa – struktury zasada 2'-deoksyryboza ryboza

4 Budowa kwasów nukleinowych część cukrowa – przesunięcia chemiczne
1H [ppm] DNA RNA G A C T G A C U H1' H2' H2'' H3' H4' H5' H5'' 13C [ppm] DNA RNA C1' C2' C3' C4' C5'

5 Budowa kwasów nukleinowych zasady azotowe – struktury
A, G – puryny C, T(U) - pirymidyny tymina cytozyna uracyl guanina adenina

6 Budowa kwasów nukleinowych zasady azotowe – przesunięcia chemiczne 1H
zasada niewymienialne wymienialne T H(6) NH (3) 13-14 CH3(5) U H(5) NH(3) 13-14 H(6) C H(5) NH2(4) / H(6)   A H(2) NH2(6) 5-6 / 7-8  H(8) G H(2) NH(1) H(8) NH2(2) 5-6 / 8-9

7 Budowa kwasów nukleinowych
zasady azotowe – przesunięcia chemiczne 13C i 15N DNA RNA G A C T G A C U N C N C C C N C N NH

8 Budowa kwasów nukleinowych sprzężenia spinowe
cukier 1J(C1’H1’) 1J( C2’H2’) 1J( C3’H3’) 1J( C4’H4’) 1J( C5’H5’) 1J( C5’H5’’) zasada azotowa imina 1J(NH) 1J(CH) 1J(C8N9) 1J(C8N7) 1J(C6N1) cukier – zasada 1J(C1’N1) 1J(C1’N9)

9 Komplet sprzężeń 1J w guaninie
calc GTP exp C8-H8 210.0 216.3 N2-H2 -93.3 -91.7 -90.1 C4-C5 57.6 63.5 C4-N9 -19.8 -19.2 C5-C6 96.6 87.9 C5-N7 6.8 4.1 C6-N1 -2.0 -5.9 C8-N9 nakład C8-N7 -8.7 K. Ruszczyńska et al., Biophysical Journal, 85, 1450 (2003).

10 Struktura drugorzędowa kwasów nukleinowych

11 Struktury przestrzenne kwasów nukleinowych dwuniciowe helisy
B Z B: typowa dla dwuniciowego DNA w komórkach A: dwuniciowy RNA i DNA+RNA Z: obszary DNA posiadające naprzemiennie puryny i pirymidyny; np. 5'-CGCGATCG-3'

12 Struktury przestrzenne kwasów nukleinowych
trypleksy tetrapleksy

13 Motywy drugorzędowe struktury RNA
Struktury przestrzenne kwasów nukleinowych Motywy drugorzędowe struktury RNA Rodzaje RNA rybosomalny (rRNA) matrycowy (mRNA) transportujący (tRNA) niekodujący (ncRNA) Struktury RNA

14 Przypomnienie Ogólna strategia wyznaczania struktur białek 1) Przypisanie sygnałów. 2) Identyfikacja więzów. 3) Generowanie struktur spełniających więzy doświadczalne. Postępowanie w punktach 1 i 2 zależy od wielkości badanego białka lub kompleksu białkowego. Postępowanie w punkcie 3 zależy od rodzajów i liczby dostępnych więzów.

15 Ogólna strategia wyznaczania struktur kwasów nukleinowych
1) Przypisanie sygnałów. 2) Identyfikacja więzów. 3) Generowanie struktur spełniających więzy doświadczalne. Postępowanie w punktach 1 i 2 zależy od wielkości badanego kwasu nukleinowego. Postępowanie w punkcie 3 zależy od rodzajów i liczby dostępnych więzów.

16 RNA - 34 nt; typowe widmo 1H NMR
H2',H3',H4',H5',H5'' H2,H6,H8,NH2 H5,H1' NH

17 DNA - 20 nt; typowe widmo 1H NMR
różnice względem RNA: H2',H2'' oddzielone; CH3(T)

18 Przypisanie sygnałów: RNA - korelacje H1'/H2'

19 Przypisanie sygnałów: RNA – korelacje H1'/C1'
20-nt RNA, naturalna zawartość 13C, 30 oC

20 Przypisanie sygnałów: RNA –korelacje H2'/C2'…H5'H5''/C5'

21 Przypisanie sygnałów: DNA – korelacje H2/H7 w tyminach

22 Przypisanie sygnałów: korelacje H5/H6
w cytozynach i uracylach

23 Przypisanie sygnałów: korelacje C5/H5
w cytozynach i uracylach

24 Przypisania sekwencyjne: korelacje 1H/31P

25 800 MHz, m=300ms, 100% 2H2O, 25°C H1' / H5 (ppm)
Przypisania sekwencyjne: RNA – korelacje H5/H1' A A G A 15 2D NOESY C G G1 U A 20 G C G C A 10 A U U U 25 G C C33 H2 / H6 / H8 (ppm) A U U G G C 5 2.45 Å C26 H5-H6 G C 30 A U G C G C 5’ 3’ 800 MHz, m=300ms, 100% 2H2O, 25°C H1' / H5 (ppm)

26 Przypisania sekwencyjne: RNA – korelacje H6,H8/H1'
20 nt RNA, NOESY

27 Przypisania sekwencyjne: DNA – korelacje H6,H8/H1'
27 nt DNA, NOESY

28 Inne możliwe przypisania sekwencyjne: DNA i RNA
H6,H8/H2' H6,H8/H2' H6,H8/H2'' 2H6,H8/H3' H6,H8/H4'

29 Przypisania sekwencyjne: korelacje protonów iminowych (tylko G i T/U)
U20G21 G19 A22 G18 – C23 G17 – C24 C16 – G25 A15 – U26 U13 C14 – G27 C12 C11 U10 U9 A8 C7 – G28 A6 – U29 G5 – C30 G4 – C31 A3 – U32 G2 – C33 G1 – C34

30 Przypisania w oligonukleotydach znakowanych
cukry 3D HCCH-COSY 3D HCCH-TOCSY zasady 3D HbCbNb H6-C6-N1 H8-C8-N9

31 Przypisania w oligonukleotydach znakowanych : cukier - zasada
3D HCN lub 2D H(C)N H1'-C1' -N1/N9

32 Przypisania w oligonukleotydach znakowanych : cukier - zasada
2D H(C)N

33 1hJNH Więzy wiązań wodorowych – parowanie zasad 2JNN 2D H(N)N-COSY
2 – 4 Hz 6 – 7 Hz 2JNN 2D H(N)N-COSY

34 Parowanie zasad 10 2D HNN-COSY 2D NOESY N1 N3 15N (ppm) N3 1H (ppm) N1
800 MhHz, 95% H2O, 5°C H (ppm) 10 800 MHz, 95% H2O, 5°C H (ppm)

35 Powody, dla których dotychczas wyznaczono niewiele struktur oligonukleotydów
DNA mało interesujące – podwójna helisa, parowanieW-C RNA – interesujące, ale znacznie trudniejsze: widma trudniejsze w interpretacji – degeneracja przesunięć chemicznych w cukrach, trudne w otrzymywaniu: trzeba dysponować znakowanymi trójfosforanami rybonukleotydów, matrycą DNA i polimerazą RNA; niska wydajność, bardzo trudne w utrzymaniu: rozkład powodują ślady metali, nukleazy, autoliza i znikają