Biofizyka makrocząsteczek c.d. Peptydy i białka Biofizyka makrocząsteczek c.d.

Mapa konformacyjna wg. Ramachandrana (1963) Legenda: Regin dozwolony Prawoskrętny helix Antyrównoległa struktura  Równoległa struktura  Potrójny helix kolagenu Lewoskrętny helix Wartości N Równoległa i antyrównoległa struktura  Pierścień zawierający 5 aminokwasów Lewo-skrętny   - helix Podwójna taśma Prawoskrętny  - helix Podwójna taśma Zamknięty pierścień

Mapa konformacyjna wg. Ramachandrana c.d. Obszary „całkowicie dopuszczalne” – 7,5% Obszary „częściowo dopuszczalne” - 22,5% Mapy konformacyjne Ramachandrana umożliwiają wyjaśnienie struktur białek, nie będąc jednak pomocnymi przy ich przewidywaniu

Metody stosowane obecnie przy ustalaniu konformacji polipeptydów rentgenografia

Metody stosowane obecnie przy ustalaniu konformacji polipeptydów rentgenografia spektroskopia w podczerwieni

Metody stosowane obecnie przy ustalaniu konformacji polipeptydów rentgenografia spektroskopia w podczerwieni pomiary aktywności optycznej

Metody stosowane obecnie przy ustalaniu konformacji polipeptydów rentgenografia spektroskopia w podczerwieni pomiary aktywności optycznej pomiary efektu hiperchromowego

Metody stosowane obecnie przy ustalaniu konformacji polipeptydów pomiary wymiany izotopowej, lepkości, rozpro-szenia światła, momentów dipolowych i in. rentgenografia spektroskopia w podczerwieni pomiary aktywności optycznej pomiary efektu hiperchromowego

Założenia pomocne przy ustalaniu przewidywanej konformacji polipeptydów Struktura -helix powstaje przy długich łańcuchach peptydowych

Założenia pomocne przy ustalaniu przewidywanej konformacji polipeptydów Struktura -helix powstaje przy długich łańcuchach peptydowych Struktura  jest charakterystyczna dla krótkich peptydów

Założenia pomocne przy ustalaniu przewidywanej konformacji polipeptydów Struktura -helix powstaje przy długich łańcuchach peptydowych Struktura  jest charakterystyczna dla krótkich peptydów Prolina i hydroksyprolina mają tylko jeden kąt rotacji

Założenia pomocne przy ustalaniu przewidywanej konformacji polipeptydów Struktura -helix powstaje przy długich łańcuchach peptydowych Struktura  jest charakterystyczna dla krótkich peptydów Struktury helikalne powstają z udziałem aminokwasów o krótkich podstwnikach Prolina i hydroksyprolina mają tylko jeden kąt rotacji

Założenia pomocne przy ustalaniu przewidywanej konformacji polipeptydów Struktura -helix powstaje przy długich łańcuchach peptydowych Struktura  jest charakterystyczna dla krótkich peptydów Obecność przy węglu  atomów O lub S uniemożliwia powstawanie heliksów Struktury helikalne powstają z udziałem aminokwasów o krótkich podstwnikach Prolina i hydroksyprolina mają tylko jeden kąt rotacji

Podział aminokwasów ze względu na skłonność do tworzenia określonych konformacji łańcuchów peptydowych Aminokwasy tworzące -heliksy: Ala, Glu, Leu, Lys, Met, Tyr Aminokwasy obojętne: Gly Aminokwasy nie tworzące heliksów: - z przyczyn sterycznych: Val, Ileu - z innych przyczyn: Ser, Thr, Pro, Hypro i in.

PRZEWIDYWANA OBSERWOWANA Zgodność przewidywanej konformacji polipeptydów z konformacją rzeczywistą Struktura -  Struktura -  Struktura -  Struktura - 

Konformacje białek

Przewidywanie konformacji białka sprowadza się do określenia obszarów uporządkowanych i nieuporządkowanych, a następnie takiego wyboru wzajemnych ich położeń, aby dawały minimalną energię cząsteczki

Jedną z podstawowych metod badania struktury białek jest analiza statystyczna, w której punkt odniesienia stanowi sekwencja aminokwasów w łańcuchach peptydowych o znanej konformacji

Podział białek ze względu na ich strukturę przestrzenną Fibrylarne,

Podział białek ze względu na ich strukturę przestrzenną Fibrylarne, Globularne

Funkcje biologiczne białek fibrylarnych Strukturalne, Ochraniające (w błonach komórkowych), Enzymatyczne (kurczliwe białka mięśni)

Podstawowe konformacje występujące w białkach fibrylarnych  - heliks, Struktura - , Struktura - -cross, Struktura kolagenu

Konformacja  - heliks w białkach fibrylarnych, Występuje we wszystkich białkach typu -keratyn (tj białkach wełny, włosów, rogów, kopyt, paznokci, pazurów, piór)

Konformacja  - heliks w białkach fibrylarnych, Występuje we wszystkich białkach typu -keratyn (tj białkach wełny, włosów, rogów, kopyt, paznokci, pazurów, piór) Organizacja Protofibryle (3 prawoskrętne heliksy zwinięte w lewoskrętne zwoje)

Konformacja  - heliks w białkach fibrylarnych, Występuje we wszystkich białkach typu -keratyn (tj białkach wełny, włosów, rogów, kopyt, paznokci, pazurów, piór) Organizacja Protofibryle (3 prawoskrętne heliksy zwinięte w lewoskrętne zwoje) Mikrofibryle (produkty agregacji protofibryli o średnicy 8 nm)

Konformacja  - heliks w białkach fibrylarnych, Występuje we wszystkich białkach typu -keratyn (tj białkach wełny, włosów, rogów, kopyt, paznokci, pazurów, piór) Organizacja Protofibryle (3 prawoskrętne heliksy zwinięte w lewoskrętne zwoje) Mikrofibryle (produkty agregacji protofibryli o średnicy 8 nm) Makrofibryle (nieregularne włókna o średnicy 10 nm)

Struktura filamentów białek typu keratyny

Konformacja -  w białkach fibrylarnych, Występuje w -keratynie i fibroinie jedwabiu

Konformacja -  w białkach fibrylarnych, Występuje w -keratynie i fibroinie jedwabiu W białku wytwarzanym przez muchę Chrysopa flava występuje struktura -cross

Konformacja -  w białkach fibrylarnych, Występuje w -keratynie i fibroinie jedwabiu W białku wytwarzanym przez muchę Chrysopa flava występuje struktura -cross Tworzy płaskie wielowarstwowe układy

Konformacja -  w białkach fibrylarnych, Występuje w -keratynie i fibroinie jedwabiu W białku wytwarzanym przez muchę Chrysopa flava występuje struktura -cross Tworzy płaskie wielowarstwowe układy Zbudowane są przede wszystkim z seryny, glicyny i alaniny występujących w sekwencji Ser-Gly-Ala-Gly

Konforma-cja -  w fibroinie jedwabiu Rozmiar reszty Rozmiar reszty

Konformacja kolagenu Organizacja Potrójny prawoskrętny heliks o masie 300 kDa, średnicy 1,5 nm i długości 280 nm

Włókna kolagenowe o średnicy 500 nm Konformacja kolagenu Organizacja Potrójny prawoskrętny heliks o masie 300 kDa, średnicy 1,5 nm i długości 280 nm Agregacja Włókna kolagenowe o średnicy 500 nm

Konformacja kolagenu c.d.

Funkcje biologiczne białek globularnych Enzymatyczne, Regulacja przepuszczalności błon komórkowych, Udział w mechanizmach odporności, Udział w krzepnięcie krwi, Udział w przenoszenie energii itp.

Podstawową cechą białek globularnych jest ich różnorodność Pomimo pewnych prawidłowości – każde z białek fibrylarnych o ustalonej dotychczas strukturze, charakteryzuje się nieco inną konformacją przestrzenna

Różnorodność konformacji białek globularnych Miohemoerytryna Prealbumina Kinaza pirogronianowa, domena 1 Białko obronne tytoniu Immunoglobulina, domena V2 Heksokinaza, domena 2 (a) Dominuje -helix (b) Dominuje struktura -  (b) Konformacje mieszane

Wspólne cechy struktur białek globularnych Występują w postaci oddzielonych od siebie w przybliżeniu kulistych cząsteczek

Wspólne cechy struktur białek globularnych Występują w postaci oddzielonych od siebie w przybliżeniu kulistych cząsteczek Najczęściej występujące konformacje helikalne to -helix, mający jednak tendencje do odkształceń od formy typowej, np. w lizozymie czy karboksypeptydazie

Wspólne cechy struktur białek globularnych Występują w postaci oddzielonych od siebie w przybliżeniu kulistych cząsteczek Łańcuchy polipeptydowe zawierają fragmenty uporządkowane w postaci -helix lub struktury- oraz nieuporządkowane – przyjmujące postać kłębka statystycznego Najczęściej występujące konformacje helikalne to -helix, mający jednak tendencje do odkształceń od formy typowej, np. w lizozymie czy karboksypeptydazie

Wspólne cechy struktur białek globularnych Występują w postaci oddzielonych od siebie w przybliżeniu kulistych cząsteczek Łańcuchy polipeptydowe zawierają fragmenty uporządkowane w postaci -helix lub struktury- oraz nieuporządkowane – przyjmujące postać kłębka statystycznego Najczęściej występujące konformacje helikalne to -helix, mający jednak tendencje do odkształceń od formy typowej, np. w lizozymie czy karboksypeptydazie Typową strukturą- zdaje się być forma antyrównoległa, stwierdzona m.in. w lizozymie, rybonukleazie, papainie i dehydrogenazie mleczanowej

Białka globularne wykazują organizację przestrzenną cząsteczek na poziomie struktury trzecio- i czwartorzędowej

Pierwsze białka globularne o ustalonej strukturze trzeciorzędowej Mioglobina (1964)

Pierwsze białka globularne o ustalonej strukturze trzeciorzędowej Mioglobina (1964) Lizozym (1965)

Konformacja cząsteczki mioglobiny (wg R.E. Dickerson 1964) Aminokwas C-końcowy Aminokwas N-końcowy

Strukturę trzeciorzędową białek określa się tylko w oparciu o wyniki badań rentgenograficznych

Oddziaływania determinujące strukturę trzeciorzędową elektrostatyczne

Oddziaływania determinujące strukturę trzeciorzędową elektrostatyczne wodorowe

Oddziaływania determinujące strukturę trzeciorzędową elektrostatyczne wodorowe kowalencyjne (mostki S-S)

Oddziaływania determinujące strukturę trzeciorzędową elektrostatyczne wodorowe kowalencyjne (mostki S-S) HYDROFOBOWE

Przykład rozmieszczenia fragmentów hydrofilowych (kolor czerwony) i hydrofobowych (kolor niebieski) w cząsteczce białka

Implikacje oddziaływań hydrofobowych w cząsteczkach białek Stosunek aminokwasów polarnych do niepolarnych waha się od 1,09 do 2,99 (średnio ok. 1,45)

Implikacje oddziaływań hydrofobowych w cząsteczkach białek Stosunek aminokwasów polarnych do niepolarnych waha się od 1,09 do 2,99 (średnio ok. 1,45) Białka o niższym stosunku mają tendencje do agregacji, co powoduje zmniejszenie obszarów hydrofobowych na powierzchni kontaktu z wodą

Struktura trzeciorzędowa w białkach enzymatycznych Zmiany konformacji cząsteczki lizozymu podczas procesu katalizy: zwężenie centralnie rozmieszczonej szczeliny na skutek przyłączenia substratu, zmiana konformacji substratu – kwasu N-acetylomuraminowego z krzesełkowej do napiętej konformacji półkrzesełkowej

Przykłady współczesnych modeli cząsteczek białek globularnych (a) Arginaza (b) Peroksydaza askorbinianowa grochu (c) Dekarboksylaza S-adenozylometioniny

Struktura czwartorzędowa Opis wzajemnego położenia i oddziaływania podjednostek białkowych zorganizowanych w większe cząstki

Struktura czwartorzędowa Opis wzajemnego położenia i oddziaływania podjednostek białkowych zorganizowanych w większe cząstki Białka o strukturze czwartorzędowej zawierają z reguły 2, 4, 6 lub 8 takich samych bądź różnych podjednostek

Struktura czwartorzędowa Opis wzajemnego położenia i oddziaływania podjednostek białkowych zorganizowanych w większe cząstki Oligomery białek o strukturze czwartorzędowej mają zdolność do odwracalnej dysocjacji na podjednostki, których aktywność zanika lub pozostaje zmieniona Białka o strukturze czwartorzędowej zawierają z reguły 2, 4, 6 lub 8 takich samych bądź różnych podjednostek

Struktura czwartorzędowa Opis wzajemnego położenia i oddziaływania podjednostek białkowych zorganizowanych w większe cząstki Oligomery białek o strukturze czwartorzędowej mają zdolność do odwracalnej dysocjacji na podjednostki, których aktywność zanika lub pozostaje zmieniona Do asocjacji podjednostek dochodzi dzięki obecności komplementarnych powierzchni kontaktowych, tworzonych głównie przez reszty aminokwasowe o charakterze hydrofobowym Białka o strukturze czwartorzędowej zawierają z reguły 2, 4, 6 lub 8 takich samych bądź różnych podjednostek.

Struktura czwartorzędowa Opis wzajemnego położenia i oddziaływania podjednostek białkowych zorganizowanych w większe cząstki Oligomery białek o strukturze czwartorzędowej mają zdolność do odwracalnej dysocjacji na podjednostki, których aktywność zanika lub pozostaje zmieniona Do asocjacji podjednostek dochodzi dzięki obecności komplementarnych powierzchni kontaktowych, tworzonych głównie przez reszty aminokwasowe o charakterze hydrofobowym Białka oligomeryczne wykazują właściwości kooperatywne wynikające z wzajemnych oddziaływań między jednostkami Białka o strukturze czwartorzędowej zawierają z reguły 2, 4, 6 lub 8 takich samych bądź różnych podjednostek.

Porównanie cząsteczki mioglobiny (białko monomeryczne) i hemoglobiny (białko oligomeryczne) Koniec-N Koniec-C Koniec-C Koniec-N Mioglobina Hemoglobina

Przykłady współczesnych modeli cząsteczek białek oligomerycznych (a) Cheperonina GroEL-GroS (b) Immunoglogulina G

Charakterystyka hemoglobiny Kształt elipsoidalny o wymiarach 6,4 x 5,5 x 5,0 nm i masie 65 kDa

Charakterystyka hemoglobiny Kształt elipsoidalny o wymiarach 6,4 x 5,5 x 5,0 nm i masie 65 kDa Cząsteczka zbudowana z dwóch łańcuchów  i dwóch  A2 A2

Charakterystyka hemoglobiny Kształt elipsoidalny o wymiarach 6,4 x 5,5 x 5,0 nm i masie 65 kDa Cztery łańcuchy peptydowe rozłożone wokół dwukrotnej osi symetrii cząsteczki =144 reszty aminokwasowe =146 reszt aminokwasowych Cząsteczka zbudowana z dwóch łańcuchów  i dwóch  A2 A2

Charakterystyka hemoglobiny Kształt elipsoidalny o wymiarach 6,4 x 5,5 x 5,0 nm i masie 65 kDa Struktura trzeciorzędowa pojedynczych łańcuchów zbliżona jest do mioglobiny Cztery łańcuchy peptydowe rozłożone wokół dwukrotnej osi symetrii cząsteczki =144 reszty aminokwasowe =146 reszt aminokwasowych Cząsteczka zbudowana z dwóch łańcuchów  i dwóch  A2 A2

Charakterystyka hemoglobiny Kształt elipsoidalny o wymiarach 6,4 x 5,5 x 5,0 nm i masie 65 kDa Struktura trzeciorzędowa pojedynczych łańcuchów zbliżona jest do mioglobiny Cztery łańcuchy peptydowe rozłożone wokół dwukrotnej osi symetrii cząsteczki =144 reszty aminokwasowe =146 reszt aminokwasowych Cząsteczka zbudowana z dwóch łańcuchów  i dwóch  A2 A2 Łańcuchy  i  otaczają wolną przestrzeń wzdłuż osi cząsteczki (tzw. Jama wewnętrzna lub centralna) o długości 5 nm, zawierającą polarne reszty aminokwasowe i wypełnioną wodą

Budowa hemoglobiny Koniec-N Koniec-C

Oddziaływania w cząsteczce Przeważnie niepolarne (hydrofobowe), Nieliczne mostki siarczkowe i wiązania jonowe (mostki solne). Brak wiązań kowalencyjnych

Oddziaływania w cząsteczce Przeważnie niepolarne (hydrofobowe), Nieliczne mostki siarczkowe i wiązania jonowe (mostki solne). Brak wiązań kowalencyjnych Poszczególne oddziaływania w cząsteczce różnią się trwałością i dlatego w warunkach fizjologicznych hemoglobina występuje w równowadze między tetramerem i dimerem.

Oddziaływania w cząsteczce Przeważnie niepolarne (hydrofobowe), Nieliczne mostki siarczkowe i wiązania jonowe (mostki solne). Brak wiązań kowalencyjnych Poszczególne oddziaływania w cząsteczce różnią się trwałością i dlatego w warunkach fizjologicznych hemoglobina występuje w równowadze między tetramerem i dimerem. Wraz ze wzrostem stężenia soli zwiększa się stopień dysocjacji hemoglobiny na dimery i monomery

Rodzaje kontaktów między podjednostkami Kontakty podjednostek niejednakowych (łańcuchy różnoimienne są wzajemnie komplementarne i ściśle do siebie przylegają): - 12 = 21 – kontakty podjednostek z blisko położonymi hemami, utworzone z ok. 80 atomów (19 reszt aminokwasowych), - 11 = 22 – kontakty podjednostek z odległymi hemami, utworzone z ok. 110 atomów (34 reszty aminokwasowe) – kontakty rozleglejsze i bardziej ścisłe Kontakty podjednostek jednakowych 1 2 = 1 2 – kontakty o charakterze polarnym (mostki solne) występujące tylko w deoksyhemoglobinie (hemoglobinie odtlenowanej)

Mostki solne stabilizujące strukturę deoksyhemoglobiny 1 2 3 4 C-końcowa Arg N-końcowa Val Asp 126 Asp 94 C-końcowa His Lys 82 His 143 Lys 40 Lys 86 2:3 DPG Tetramer hemoglobiny utrzymywany jest przez 8 mostków solnych

Efekt allosteryczny Zmiany konformacji cząsteczki białkowej w skutek przyłączenia ligandów (niskocząsteczkowych związków lub jonów o charakterze substratów, aktywatorów lub inhibitorów) Efekt allosteryczny wiąże się z: Katalizą enzymatyczną, Przepuszczalnością błon komórkowych, Przenoszeniem tlenu przez hemoglobinę Przenoszeniem energii, bodźców nerwowych i in.

Modele funkcjonowania białek allosterycznych Model Monda, Wymana i Changeux 1965 (M-W-C), Model Koshlanda, Nemethy i Filmera 1966

Założenia modelu M-W-C Białka allosteryczne są oligo- bądź polimerami złożonymi z kilku identycznych podjednostek zajmujących równoważne pozycje. Cała cząsteczka jest więc symetryczna, Każda jednostka ma 1 pozycję wiążącą, co powoduje tożsamość symetrii wszystkich stereospecyficznych receptorów i całej cząsteczki, Między identycznymi pozycjami aktywnymi w cząsteczce, wiążącymi takie same ligandy występują oddziaływania (efekty) homotropowe, Między różnymi pozycjami aktywnymi wiążącymi inne ligandy następują efekty heterotropowe, Białko może istnieć w co najmniej dwóch różnych stanach konformacyjnych, różniących się powinowactwem do ligandu,

Założenia modelu M-W-C c.d. Przejścia konformacyjne od jednego stanu do drugiego są odwracalne, Podczas allosterycznego przejścia symetria cząsteczki nie zmienia się, a zatem zmiana konformacji podjednostek następuje jednocześnie, a stany przejściowe można uznać za nietrwałe. Gdzie: R – stan rozluźniony, T – stan anpięty, L –stała równowagi R T L = [T]/[R] L – stała allosteryczna, której wartość wskazuje na prawdopodobieństwo występowania białka w określonym stanie konformacyjnym

Założenia modelu Koshlanda i in. Przyłączenie ligandu przez białko oligomeryczne przebiega przez kolejno następujące po sobie zmiany konformacyjne podjednostek, przyczym: - zmiana konformacji jednego protomeru nie jest przekazywana na sąsiednie podjednostki, - podjednostki są sztywno związane i jedna z nich – wiążąca ligand – oddziaływuje na sąsiednie powodując wzrost bądź spadek ich powinowactwa do ligandu, co umożliwia występowanie różnych stanów pośrednich kolejno następujących po sobie przemian konformacyjnych.

Założenia modelu Koshlanda i in. c.d. L[A] = [B] A B B + X BX K[B] = [BX] gdzie: A, B – stany konformacyjne białka, X – ligand, K – stała równowagi reakcji każdej podjednostki z ligandem (określa powinowactwo jednostki do ligandu), L – stała równowagi charakteryzująca reakcję przemiany konformacyjnej podjednostki

Zmiany struktury hemoglobiny sprzężone z wiązaniem tlenu (oksygenacją)

Zmiany odległości między atomami Fe 2 3,34 1 2 3,99 1 2,50 2,50 2,47 2,47 3,50 3,69 1 3,60 2 1 3,49 2 (a) Oksyhemoglobina (b) Deoksyhemoglobina

Geometria wiązania Fe w cząsteczce hemoglobiny

Modyfikacja kontaktów między niejednakowymi podjednostkami 11 = 22 przesunięcie atomów rzędu 0,1 nm, 12 = 21 przesunięcie atomów rzędu 0,7 nm,

Zmiana struktury czwartorzędowej hemoglobiny na skutek oksygenacji

Łączenie się hemoglobiny z tlenem Podstawowa funkcja hemoglobiny wiąże się ze zdolnością odwracalnego łączenia się z tlenem za pośrednictwem Fe bez zmiany jego wartościowości Reakcja łączenia się hemoglobiny z tlenem nie podlega prostemu prawu oddziaływania mas ze względu na obecność w cząsteczce 4 pozycji wiążących tlen (kooperatywne wiązanie tlenu)

Oksygenacja mioglobiny połączenie za pośrednictwem 1 pozycji zgodne z prawem oddziaływania mas: Mb + O2 MbO2 Stała równowagi reakcji K = [MbO2]/[Mb][O] lub K = Y/(1-Y)pO2 Funkcja nasycenia mioglobiny tlenem Y = MbO2/([MbO2] + [Mb]) lub Y = KpO2/(1 + Kp KpO2) po zastąpieniu stężenia tlenu jego ciśnieniem parcjalnym

Oksygenacja hemoglobiny połączenie za pośrednictwem 4 pozycji niezgodne z prawem oddziaływania mas: Hb4 + O2 Hb4 (O2) Hb4 (O2) + O2 Hb4 (O2)2 Hb4 (O2)2 + O2 Hb4 (O2)3 Hb4 (O2)3 + O2 Hb4 (O2)3 Reakcji towarzyszą 4 różne stałe K (tzw stałe asocjacji lub stałe Adaira)

Oksygenacja hemoglobiny Funkcja nasycenia hemoglobiny tlenem (K1p + 2K1pK2p2 + 3K1pK2p2K3p3 + 4K1pK2p2K3p3K4p4) YO2 = 4(1 + K1p + K1 + K2p2 + K1K2K3p3 + K1K2K3K4p4

Równanie opisujące krzywą wiązania tlenu przez hemoglobinę (Hill, 1910) Y/(1-Y) = K(pO2)n

Krzywe dysocjacji telnowej hemoglobiny (A) i mioglobiny (b) 100 A Nasycenie hemoglobiny tlenem (%) B 5,3 x 103 13,3 x 103 Ciśnienie tlenu w Pa