Rys. 3. Widmo NOESY wraz z przypisaniem sekwencyjnym.

Prezentacja na temat: "Rys. 3. Widmo NOESY wraz z przypisaniem sekwencyjnym."— Zapis prezentacji:

1 Rys. 3. Widmo NOESY wraz z przypisaniem sekwencyjnym.
Wyznaczenie trójwymiarowej struktury inhibitora proteaz serynowych białka SPI-2 i jego mutantów metodami spektroskopii NMR. Urszula Nowicka Promotor: Prof. dr hab. Wiktor Koźmiński, Uniwersytet Warszawski Opiekun : dr Igor Zhukov, Instytut Biochemii i Biofizyki PAN Praca została wykonana w Pracowni Oddziaływań Międzycząsteczkowych Wydziału Chemii UW, oraz w Środowiskowym Laboratorium NMR Instytutu Biochemii i Biofizyki PAN. Inhibitory proteaz serynowych są szeroko rozpowszechnione wśród zwierząt i roślin. Można je podzielić na 11 grup. SPI-2 (silk proteinase inhibitor) jest inhibitorem proteaz serynowych zbudowanym z 36 aminokwasów. Białko to odkryto w nici ćmy Galleria Mellonella[1] gdzie pełni istotną rolę w ochronie nici jedwabiu przed degradacją (Rys. 1). SPI-2 jest jednodomenowym białkiem należącym do rodziny Kazal. Inhibitory typu Kazal charakteryzują się dużą stabilnością struktury zapewnianą przez mostki dwusiarczkowe. W strukturze wyróżnić można elementy struktury drugorzędowej: trzy β-kartki ułożone w sposób antyperiplanarny oraz α-helisę. SPI-2 w przeciwieństwie do innych inhibitorów tej rodziny ma dwa, a nie trzy mostki dwusiarczkowe (Rys. 2). Badania dowodzą, iż SPI-2 wykazuje bardzo wysoką aktywność biologiczną względem proteaz bakteryjnych takich jak subtylizyny, oraz proteaz grzybowych (proteinaza K)[2]. Badane białka zostały otrzymane w układzie Rys. 1. Galleria Mellonella. Rys. 4. Dwadzieścia struktur o najniższej energii nałożone na siebie. Na brązowo zaznaczono aminokwas znajdujący się w pozycji P1, na żółto zaznaczono mostki dwusiarczkowe. A. Białko SPI-2 z Thr w pozycji P1. B. Białko SPI-2 z Ala w pozycji P1. C. Białko SPI-2 z Tyr w pozycji P1. Struktury trzeciorzędowe białek (Rys. 4) obliczone zostały za pomocą programów CYANA[3] i XPLOR[4]. Struktury wszystkich trzech białek cechują się dużym podobieństwem (Rys. 5), i wyróżnić w nich można cechy charakterystyczne dla inhibitorów rodziny Kazal. Otrzymane struktury posłużyły do zbudowania realistycznych modeli kompleksów proteaza-inhibitor (Rys. 6), co pozwoliło na zrozumienie szczegółów mechanizmu ich oddziaływania. Wyniki pracy zostaną wykorzystane w dalszych badaniach nad uzyskaniem nowego typu inhibitorów proteaz serynowych. Rys. 2. SPI-2 jako inhibitor typu Kazal. Wiązania dwusiarczkowe zaznaczono kolorem żółtym. Pichia Pastoris, a łańcuchy aminokwasowe został wydłużone o 3 aminokwasy na N-końcu oraz o ogon histydynowy na C-końcu łańcucha. Jak zostało ustalone, różne podstawienia w pozycji P1 Rys. 3. Widmo NOESY wraz z przypisaniem sekwencyjnym. prowadzą do zróżnicowania substratowej specyficzności w stosunku do proteaz serynowych. Celem prowadzonych badań jest uzyskanie inhibitora wykazującego dużą aktywność względem proteaz serynowych. Bezpośrednim celem tej pracy było ustalenie struktury białka natywnego z Thr w pozycji P1, oraz dwóch białek zmodyfikowanych, które Thr w pozycji P1 zastąpioną miały przez Ala lub Tyr. Widma zarejestrowane zostały na spektrometrze NMR Varian Unity Przypisanie sygnałów zostało przeprowadzone na podstawie dwuwymiarowych widm homokorelacyjnych TOCSY (10ms, 80ms), NOESY (50ms, 200ms) (Rys. 3) oraz heterokorelacyjnych HSQC 1H-15N, 1H-13C, przy naturalnej zawartości 15N i 13C. Rys. 5. Nałożone na siebie łańcuchy główne wszystkich trzech białek, których struktury zostały ustalone. Rys. 6. Modele kompleksów białka SPI-2 z proteazami serynowymi. Na niebiesko zaznaczono białko SPI-2, na różowo miejsce aktywne białka SPI-2, na turkusowo zaznaczono proteazę, na żółto miejsce oddziaływania, na czerwono aminokwas w pozycji P1 białka SPI-2. A. Model kompleksu białka SPI-2 z Thr w pozycji P1 z subtylizyną. B. Model kompleksu białka SPI-2 z Tyr w pozycji P1 z trypsyną. Literatura: [1] Nirmala X., Kodrik D., Zurovec M., Sehnal F. (2001) Eur. J. Biochem., 268, 2064. [2] Kludkiewicz, B., et al., (2005) Prot. Expr. & Purif., 43, 94. [3] Guntert P., Mumenthaler C., Wuthrich K. (1997) J. Mol. Biol., 273, 283. [4] Schwieters C.D., Kuszewski J.J., Tjandra N., Clore G.M. (2003) J. Magn. Reson., 160, 66 kontakt: