SYNTEZA L-TRYPTOFANU ZNAKOWANEGO W PIERŚCIENIU I ŁAŃCUCHU BOCZNYM IZOTOPAMI WODORU I WĘGLA Paweł Dąbrowski Praca magisterska wykonana na Pracowni Peptydów Wydziału Chemii Uniwersytetu Warszawskiego Promotor i opiekun pracy: Dr Elżbieta Winnicka L-Tryptofan Aminokwas obojętny Egzogenny Punkt izoelektryczny wynosi 5,89 Składnik białek Ulega przekształceniu do tryptamin (serotonina, melatonina) Cele pracy Opracowanie metody syntezy L-tryptofanu selektywnie znakowanego izotopami wodoru (deuterem i trytem) w pozycji 4 w pierścieniu aromatycznym. Opracowanie metody syntezy L-tryptofanu selektywnie znakowanego izotopami węgla w pozycji 3 w łańcuchu alifatycznym. Opracowanie metody syntezy L-tryptofanu nie selektywnie znakowanego izotopami wodoru (deuterem i trytem) w pierścieniu aromatycznym. Opracowanie metody wydzielenia i identyfikacji izotopomerów L-Tryptofanu Badanie kinetycznych efektów izotopowych w reakcji katalizowanej przez tryptofanazę Reakcja nie selektywnej wymiany izotopowej w pierścieniu aromatycznym Temperatura pokojowa, ciemności, 3 dni, mieszanie 80% podstawienie Użycie HTO prowadzi do powstania produktu podstawionego trytem, a DTO podstawionego mieszaniną deuteru i trytu. [2’,4’,5’,6’,7’–D]-L-Trp oczyściłem poprzez krystalizację, natomiast tryptofan podstawiony promieniotwórczym trytem oczyściłem na kolumnie jonowymiennej (amberlit IR 120 H+) Multienzymatyczna synteza L-tryptofanu znakowanego węglem C-14 w pozycji 3 w łańcuchu alifatycznym: D-AAO – D-amino acid oxidase GTP – glutamic-puryvic-transamidase Tryptofanaza, bufor [3- C]-DL-alanina 14 Reakcja selektywnej wymiany izotopowej pod wpływem promieniowania elektromagnetycznego lampy rtęciowej Oczyszczenie – kolumna silikagel Postęp reakcji kontrolowałem przy pomocy magnetycznego rezonansu jądrowego. Po 72 godzinach osiągnąłem 70 % podstawienia w pozycji 4. Układ eluujący: acetonitryl : woda 4 : 1 [4’-D]-L-Trp Naświetlanie 72 h Woda deuterowana Podsumowanie Postawione przede mną zadania zostały zrealizowane w ramach mojej pracy magisterskiej: Opracowałem metodę otrzymania i oczyszczenia tryptofanu znakowanego izotopami wodoru w pozycji 4 w pierścieniu aromatycznym. [4-D]-L-Tryptofan [4-T]-L-Tryptofan [4-D/T]-L-Tryptofan Opracowałem metodę otrzymania i oczyszczenia tryptofanu znakowanego izotopami wodoru nie selektywnie w pierścieniu aromatycznym. [2’,4’,5’,6’,7’-D]-L-Tryptofan [2’,4’,5’,6’,7’-T]-L-Tryptofan [2’,4’,5’,6’,7’-D/T]-L-Tryptofan Opracowałem metodę otrzymania i oczyszczenia tryptofanu znakowanego węglem C-14 w pozycji 3 w łańcuchu alifatycznym Wyznaczyłem kinetyczne efekty izotopowe z w reakcji katalizowanej przez tryptofanazę Czystość otrzymanych związków potwierdzałem metodami enzymatycznymi, chromatograficznymi (TLC), spektoskopowymi (NMR) i radiochemicznymi. Badania kinetyczne Tryptofan pod wpływem enzymu tryptofanazy ulega rozkładowi na indol, kwas pirogronowy i amoniak. Kinetyczne i rozpuszczalnikowe efekt izotopowy wyznaczyłem dla [4’-D]-L-tryptofanu HTO DTO [3- C]-L-tryptofan Kinetyczny efekt izotopowy: Rozpuszczalnikowy efekt izotopowy: