Opracowanie enzymatycznej syntezy kwasu fenylopirogronowego i jego pochodnych. Pracownia Peptydów Wydziału Chemii UW Jarosław Stańczewski Promotor pracy : prof. dr hab. Marianna Kańska Opiekun pracy: mgr Katarzyna Skowera Otrzymywanie znakowanego kwasu fenylopirogronowego. Jest to synteza dwuetapowa. Substratem wyjściowym był znakowany kwas E - cynamonowy, który przekształcono w znakowaną izotopem węgla w grupie karboksylowej L - fenyloalaninę według następującego schematu: Struktura liazy fenyloalaninowej (PAL) W drugim etapie syntezy otrzymano znakowany kwas fenylopirogronowy ze znakowanej L-fenyloalaniny według następującego schematu: Struktura dehydrogenazy fenyloalaninowej (PheDH) Literatura: 1. The Jurnal of Biological Chemistry „Phenylalanine Hydroxylase from Pseudomonas sp. (ATCC 11299a)” Carol H. Letendre , Geneva Dickens, Gordon Guroff 2. Brain Research „The effects of L-phenylalanine and phenylpyruvate on glycolysis in rat cerebral cortex” Robert I. Glazer, George Weber 3. Biochemistry „Rhodococcus L-phenylalanine dehydrogenase : kinetics mechanism, and structural basis for catalytic specifity” Norbert M. W. Brunhuber, James B.Thoden, John S. Blanchard, Janeen L. Vanhooke Cele pracy magisterskiej: a) Opracowanie: - enzymatycznej metody otrzymania znakowanej izotopem węgla w grupie karboksylowej L-fenyloalaniny z kwasu E - cynamonowego - metody wydzielenia L-fenyloalaniny z mieszaniny poreakcyjnej - enzymatycznej metody otrzymania znakowanego izotopem węgla w grupie karboksylowej kwasu fenylopirogronowego z L-fenyloalaniny - metody wydzielania kwasu fenylopirogronowego z mieszaniny poreakcyjnej - metod identyfikacji kwasu fenylopirogronowego i L-fenyloalaniny - metody otrzymania kwasu p-hydroksyfenylopirogronowego z L - tyrozyny - metody wydzielania kwasu p-hydroksyfenylopirogronowego z mieszaniny poreakcyjnej - metody identyfikacji kwasu p-hydroksyfenylopirogronowego i L - tyrozyny b) badania efektu rozpuszczalnikowego Otrzymywanie kwasu p-hydroksyfenylopirogronowego z tyrozyny i badania kinetyczne tej reakcji. Schemat otrzymania kwasu p-hydroksyfenylopirogronowego: Badania kinetyczne, których celem było wyznaczenie wartości kinetycznych (KM – stałej Michaelisa oraz Vmax – szybkości maksymalnej), zostały przeprowadzone na spektrofotometrze. Było to możliwe dzięki zastosowaniu odpowiedniego kofaktora, którym był dinukleotyd nikotynoamidoadeninowy (NAD+): Zredukowana forma tego dinukleotydu wykazuje większe wartości absorbancji niż forma niezredukowana, co zostało wykorzystane do wyznaczania parametrów kinetycznych a później efektu rozpuszczalnikowego (k = 1,38), a także do badania przebiegu reakcji: Przykładowa synteza związku znakowanego izotopem węgla (znakowanej tyrozyny): Znakowanie izotopowe - technika badawcza stosowana głównie w chemii organicznej polegająca na wymianie wybranych atomów danego pierwiastka w cząsteczce na jego izotop. Tak wymieniony atom jest „oznakowany”, dzięki czemu można go obserwować rozmaitymi technikami analitycznymi. Izotopy wprowadza się do cząsteczek w trakcie syntezy związków chemicznych, stosując odpowiednio zmodyfikowane substraty. Najczęściej stosuje się izotopy promieniotwórcze, ale współczesne techniki analityczne umożliwiają też stosowanie izotopów stabilnych. Znakowanie izotopowe bywa stosowane w celu: badania mechanizmów reakcji chemicznych, które polegają na stwierdzeniu obecności izotopu w produktach. Metody stosowane to: badanie kinetycznego efektu izotopowego lub bezpośrednie śledzenie znakowanych atomów metodami spektroskopowymi badania dynamiki ruchów fragmentów cząsteczek, co czyni się zazwyczaj metodami spektroskopowymi śledzenia dróg wędrówki określonych związków chemicznych w organizmach żywych Do śledzenia znakowanych atomów stosuje się między innymi następujące techniki analityczne: spektroskopię EPR NMR spektroskopię mas pozytonową emisyjną tomografię komputerową