Określanie mechanizmów reakcji enzymatycznych Enzymologia-6 Określanie mechanizmów reakcji enzymatycznych Przykłady

Enzym hydrolityczny rozkładający peptydoglikan ściany komórkowej bakterii Lizozym Schemat struktury peptydoglikanu Reakcja katalizowana przez enzym Hydroliza wiązania glikozydowego między atomem węgla C-1 reszt kwasu N-acetylomuraminowego i atomęm C-4 N-acetyloglukozaminy

Model przestrzenny cząsteczki lizozymu

Wiązania wodorowe pomiędzy (NAG)3 i lizozymem

Sposób wiązania (NAG)6 z lizozymem Kolor żółty - (NAG)6 ; kolor niebieski – reszty aminokwasowe enzymu; Kolor czerwony – reszty aminokwasowe enzymu biorące bezpośredni udział w katalizie

Struktura części centrum aktywnego lizozymu. Kolorem żółtym oznaczono atomy pierścieni D i E substratu (NAG)6

Badanie specyficzności substratowej lizozymu Porównanie szybkości hydrolizy oligomerów NAG NAG2 0 NAG5 4 000 NAG3 1 NAG6 30 000 NAG4 8 NAG8 30 000 Produkty hydrolizy: NAG6  NAG4 + NAG2

Analog substratu, laktonowa pochodna (NAG)4, wiąże się z enzymem 3 600 razy silniej niż (NAG)4. Wniosek: związek jest analogiem stanu przejściowego

B C D A B C Obraz struktury kompleksu enzym:NAM-NAG-NAM. F B C D A B C D E F A B C Obraz struktury kompleksu enzym:NAM-NAG-NAM. Ligand zajmuje miejsce B-C-D, a nie A-B-C, bo NAM jest zbyt duży aby zająć miejsce C. NAM w miejscu D przyjmuje konformację półkrzesłową

Określenie miejsca hydrolizy substratu Które wiązanie ulega hydrolizie? Informacje wyjściowe: w peptydoglikanie hydrolizowane jest wiązanie NAM-NAG (NAG)3 nie ulega hydrolizie; NAM nie może zajmować miejsca C (zawada przestrzenna)

Ustalenie roli reszt katalitycznych Profil zależności szybkości reakcji od pH Klasyczna krzywa dzwonowa. Maksimum około pH = 5.0 Spadek aktywności po stronie alkalicznej – wynik jonizacji Glu-35 Spadek aktywności po stronie kwasowej – wynik protonowania Asp52 Modyfikacja chemiczna Estryfikacja Asp52 – całkowita utrata aktywności; związanie substratu chroni enzym przed inaktywacją

Mechanizm reakcji katalizowanej przez lizozym Etap I – protonowanie atomu tlenu wiązania glikozydowego przez Glu 35 Etap II – przyłączenie anionu OH- z wody do jonu karboniowego i H+ do grupy COO- reszty Glu 35

Chymotrypsyna Enzym proteolityczny, wytwarzany przez trzustkę w formie proenzymu (chymotrypsynogen). Chymotrypsyna należy do grupy proteaz serynowych Specyficzność substratowa ustalona na podstawie peptydów modelowych Reszta seryny 195 jest szczególnie reaktywna. Selektywna modyfikacja przez DIPF oraz PMSF

Modyfikacja chemiczna Ukierunkowana mutageneza Mutant Asp102Asn wykazuje kkat 5000 razy niższe niż enzym typu dzikiego TPCK – specyficzny inaktywator chymotrypsyny Ser195, His57 i Asp102 tworzą triadę katalityczną TPCK alkiluje resztę His 57

Struktura przestrzenna chymotrypsyny

Wiązanie substratu Hydrofobowa kieszeń chymotrypsyny; miejsce rozpoznania i wiązania substratu Porównanie miejsc wiązania substratu w niektórych proteazach serynowych

Określenie mechanizmu katalizy Detekcja intermediatów - acyloenzym Acyloenzym powstający w wyniku działania octanu p-nitrofenylu na chymotrypsynę można wyizolować, jeżeli reakcję prowadzi się w niskim pH

Określenie mechanizmu katalizy Detekcja intermediatów – tetraedryczny stan przejściowy 1. Niskotemperaturowy 13C NMR Przejściowy produkt reakcji można wykryć poprzez identyfikację sygnału pochodzącego od znakowanego atomu węgla 2. Inhibitory – analogi stanu przejściowego

Mechanizm reakcji katalizowanej przez chymotrypsynę

Stabilizacja stanu przejściowego w centrum aktywnym

Analogi stanu przejściowego w medycynie

Tetraedryczny związek pośredni Stan przejściowy Enzym Tetraedryczny związek pośredni Stan przejściowy Stan przejściowy Analog stanu przejściowego Lepszy analog stanu przejściowego ale chemicznie niestabilny

Penicylina – analog stanu przejściowego D-alanylo-D-alaniny