Praktikum z biologii komórki dla biologów Zasady zaliczenia: uczestniczenie w zajęciach (dopuszczana 1 nieobecność usprawiedliwiona ) przygotowywanie się na ćwiczenia ( sprawdzanie wiadomości - oceny cząstkowe) przygotowanie i wygłoszenie referatu (obligatoryjne) kolokwium zaliczeniowe Charakterystyka kursu: 90 godzin laboratoryjnych Koordynator: dr Marta Michalik (p. C118) Prowadzący: nauczyciele akademiccy i doktoranci ZBK oraz Pracowni Biofizyki Komórki Ocena z kursu jest średnią ważoną: ocen cząstkowych otrzymanych przez studenta w trakcie ćwiczeń praktycznych (oceny od każdego prowadzącego zajęcia) wraz z oceną z referatu (50%) oceny z kolokwium zaliczeniowego (50%)

Praktikum z biologii komórki (BT 226) Zasady zaliczenia kursu Podstawowe zasady przestrzegania przepisów BHP: - zasady pracy w laboratorium o poziomie zagrożenia biologicznego BL- 1 - zasady BHP w pracowni chemicznej Plan wszystkich zajęć laboratoryjnych ĆWICZENIA ORGANIZACYJNE

ZAKŁADANIE HODOWLI PIERWOTNYCH FIBROBLASTÓW ZARODKA KURCZĘCIA Ćwiczenie ma na celu z apoznanie się z podstawowymi technikami bezpośredniej izolacji komórek z tkanek i ich przygotowania do hodowli w układach in vitro Zagadnienia do przygotowania: 1.Hodowle komórkowe in vitro Zalecana literatura: Instrukcje do ćwiczeń 1.D. F. Huelser „Mammalian Cell Culture Methods” Etapy procedury: 1.Pozyskanie tkanki z organizmu 2.Dysocjacja tkanki 3.Oczyszczanie uzyskanej populacji z niepożądanych typów komórek 7-dzień20-dzień

Celem ćwiczenia jest zapoznanie się z techniką zakładania hodowli agregatów komórek serca zarodka kurczęcia. Omówione zostaną zagadnienia dotyczące badań nad macierzystymi komórkami serca. Tematy referatów: 1. Mechanizm skurczu mięśni poprzecznie prążkowanych i mięśni gładkich 2. Porównanie morfologii i funkcji komórek mięśni poprzecznie prążkowanych, mięśni gładkich i komórek mięśnia serca Materiał obowiązujący do ćwiczeń: Budowa serca – mechanizm skurczu TRÓJWYMIAROWE HODOWLE KOMÓREK MIĘŚNIA SERCOWEGO

METODY IMMUNOCYTOCHEMICZNE BARWIENIA FLUORESCENCYJNE KOMÓREK PRAWIDŁOWYCH I NOWOTWOROWYCH Zagadnienia do przygotowania: 1. Organizacja, funkcje i metody badania cytoszkieletu w komórkach zwierzęcych (prawidłowych i nowotworowych). 2. Metody immunocytochemiczne i ich znaczenie w badaniach biologii komórki. 3. Zastosowanie barwników fluorescencyjnych w badaniach struktury i funkcji komórek. Zalecana literatura: B. Alberts i inni – Podstawy Biologii Komórki, PWN 2005; rozdz.17. Red. J. Kawiak i M. Zabel – Seminaria z cytofizjologii, WMed 2002, rozdz.7 i 14 Red. M. Jakóbisiak – Immunologia, PWN 1996, rozdz. 5 i 7 Red. M. Zabel – Immunocytochemia, PWN 1999, rozdz.1, 2 i 4 Kursy: „Podstawy biologii komórki” i „Biologia komórki” – Budowa i funkcje cytoszkieletu Temat referatu: Metody immunocytochemiczne w badaniach biologii komórki Ćwiczenie ma na celu wykazanie obecności i kolokalizacji rożnych struktur w komórkach zwierzęcych poprzez równoczesne wybarwienie ich kilkoma barwnikami fluorescencyjnymi (cytoimmunofluorescencja pośrednia)

ZASTOSOWANIE METOD IMMUNOCYTOCHEMICZNYCH W DIAGNOSTYCE NOWOTWORÓW Cel ćwiczenia: wykorzystanie metody immunocytofluorescencji pośredniej do identyfikacji komórek prawidłowych i nowotworowych w hodowlach in vitro Temat referatu: Wykorzystanie metod immunocytochemicznych w diagnostyce medycznej Zagadnienia do przygotowania: 1. Cechy komórek nowotworowych 2. Metody immunocytochemiczne w diagnostyce nowotworów 3. Zastosowanie barwników fluorescencyjnych w badaniach struktury i funkcji komórek. Zalecana literatura: Red. J. Kawiak i M. Zabel – Seminaria z cytofizjologii, WMed 2002, rozdz..7 i 14. Red. M. Jakóbisiak – Immunologia, PWN 1996, rozdz. 5 i 7. Red. M. Zabel – Immunocytochemia, PWN 1999, rozdz..1, 2 i 4 Red. I. Kątnik Prastowska – Immunochemia w biologii medycznej, PWN 2009, rozdz. 1, 2.1

ZASTOSOWANIE METOD IMMUNOCYTOCHEMICZNYCH W DIAGNOSTYCE NOWOTWORÓW Cel ćwiczenia: wykorzystanie metody immunocytofluorescencji pośredniej do identyfikacji komórek prawidłowych i nowotworowych w hodowlach in vitro Temat referatu: Wykorzystanie metod immunocytochemicznych w diagnostyce medycznej Zagadnienia do przygotowania: 1. Cechy komórek nowotworowych 2. Metody immunocytochemiczne w diagnostyce nowotworów 3. Zastosowanie barwników fluorescencyjnych w badaniach struktury i funkcji komórek. Zalecana literatura: Red. J. Kawiak i M. Zabel – Seminaria z cytofizjologii, WMed 2002, rozdz..7 i 14. Red. M. Jakóbisiak – Immunologia, PWN 1996, rozdz. 5 i 7. Red. M. Zabel – Immunocytochemia, PWN 1999, rozdz..1, 2 i 4 Red. I. Kątnik Prastowska – Immunochemia w biologii medycznej, PWN 2009, rozdz. 1, 2.1

ZASTOSOWANIE CYFROWYCH, CHŁODZONYCHCH KAMER CCD W MIKROSKOPII FLUORESCENCYJNEJ Zalecana literatura: 1. Podstawy biologii komórki, Wprowadzenie do biologii molekularnej pod redakcją B. Alberts`a Zagadnienia do przygotowania: 1. Zasada działania mikroskopu fluorescencyjnego 2. Podstawowe pojęcia dotyczące komputerowej analizy obrazu 3. Zasada działania kamer CCD Jednym ze sposobów zapisu obrazu z mikroskopii fluorescencyjnej jest zastosowanie cyfrowych kamer CCD. Celem ćwiczeń jest poznanie podstawowych zasad użycia tego rodzaju sprzętu współdziałającego ze zautomatyzowanym mikroskopem fluorescencyjnym Ćwiczenie ma na celu: 1. Praktyczne poznanie podstawowych zasad działania cyfrowych kamer CCD. 2. Poznanie zasad obsługi automatycznego mikroskopu fluorescencyjnego.

ZASTOSOWANIE ZAUTOMATYZOWANYCH SYSTEMÓW MIKROSKOPOWYCH DO POKLATKOWEJ REJESTRACJI PROCESÓW BIOLOGICZNYCH Zalecana literatura: 1. Podstawy biologii komórki, Wprowadzenie do biologii molekularnej pod redakcją B. Alberts`a. 2. ging/index.html 3. Z. Madeja. Wpływ homo- i heterotypowych oddziaływań komórka-komórka na aktywność ruchową komórek nowotworowych. Seria Wydawnicza Instytutu Biologii Molekularnej i Biotechnologii UJ. Kraków str Zagadnienia do przygotowania: 1. Zasada działania mikroskopu fluorescencyjnego 2. Podstawowe pojęcia dotyczące komputerowej analizy obrazu 3. Zasada działania kamer CCD 4. Metody określania aktywności ruchowej komórek We współczesnej biologii komórki szczególne zainteresowanie budzą możliwości poklatkowej rejestracji różnych procesów obserwowanych pod mikroskopem. Dostępne obecnie techniki mikroskopii cyfrowej umożliwiają stosunkowo proste przeprowadzanie takich doświadczeń Ćwiczenie ma na celu: 1.Poznanie zasad obsługi automatycznego mikroskopu fluorescencyjnego 2.Przeprowadzenie doświadczenia polegającego na wykorzystaniu systemu mikroskopowego do rejestracji migracji komórek w zadanym okresie czasu, przy określonym kroku czasowym oraz wybraniu kilku różnych miejsc analizowanego preparatu

REJESTRACJA I ANALIZA MIGRACJI KOMÓREK ZWIERZĘCYCH. ROLA KINAZY BIAŁKOWEJ C W REGULACJI AKTYWNOŚCI RUCHOWEJ KOMÓREK KONTROLA Zalecana literatura: 1. Podstawy biologii komórki, Wprowadzenie do biologii molekularnej pod redakcją B. Alberts`a. 2. Klein A. (2002) Molekularne podstawy regulacji hormonalnej. Sygnalizacja międzykomórkowa i wewnątrzkomórkowa. (str ) 3. Sroka J.(2009) Wpływ organicznych pochodnych cyny i ołowiu na migrację komórek zwierzęcych oraz międzykomórkową komunikację za pośrednictwem złącz szczelinowych (str ) 4. Wiadomości z ćwiczeń z biologii komórki dotyczące mechanizmów ruchów komórkowych Zagadnienia do przygotowania: 1. Aktywność ruchowa komórek niemięśniowych 2. Udział kinazy białkowej C w przekazywaniu sygnału w komórce 3. Wpływ estrów forbolu na aktywność ruchową komórek TPA Ruch komórek towarzyszy wielu procesom zachodzącym w żywych organizmach, takim jak embriogeneza, regeneracja i gojenie się ran czy reakcje obronne układu odpornościowego Ćwiczenie ma na celu: 1.Zapoznanie się z wybranymi mechanizmami regulacji ruchu komórek zwierzęcych 2. Zapoznanie się z metodami rejestracji i analizy ruchów komórek Temat referatu: Rola kinazy białkowej C w regulacji ruchów komórek

ZASTOSOWANIE SYSTEMU MIKROSKOPII TIRF W BADANIACH ORGANIZACJI CYTOSZKIELETU W KOMÓRKACH ZWIERZĘCYCH Zakład Biologii Komórki, WBBiB UJ „ The Faculty of Biochemistry, Biophysics and Biotechnology of the Jagiellonian University is a beneficient of the structural funds from the European Union (grant No: POIG /08 — “Molecular biotechnology for health”) Ćwiczenie ma na celu: 1.Zapoznanie się z metodą całkowitego odbicia wewnętrznego fluorescencji (TIRF) 2.Wizualizację białek cytoszkieletu komórek Zagadnienia do przygotowania: 1.Mikroskopia fluorescencyjna 2.TIRF Zalecana literatura: 1. escence/tirf/tirfintro.html

KOMUNIKACJA MIĘDZYKOMÓRKOWA Zagadnienia do przygotowania: 1.Zasada działania mikroskopu fluorescencyjnego 2.Analizy intensywności międzykomórkowego transferu metabolitów techniką scrape-loading 3.Test żywotności komórek z wykorzystaniem dwuoctanu fluoresceiny Zalecana literatura: 1.Instrukcje do ćwiczeń 2.Alberts, Biologia komórki Złącza szczelinowe zbudowane są z kompleksów białkowych tworzących międzykomórkowe kanały, które łączą przedziały cytoplazmatyczne sąsiednich komórek. Kanały złącz zbudowane są z dwóch koneksonów, heksamerów białek z rodziny koneksyn Ćwiczenie ma na celu zapoznanie się z ilościową techniką wizualizacji komunikacji międzykomórkowej za pośrednictwem złącz szczelinowych. Temat referatu: Budowa i funkcje koneksyn.

Acquisition of Optical Sections Image Plane Microscope Objective Focal Change (Δz) z axis Focal Plane PODSTAWY REKONSTRUKCJI OBRAZÓW MIKROSKOPOWYCH W PRZESTRZENI TRÓJWYMIAROWEJ Pinaki Sarder and Arye Nehorai Obowiązujący materiał: - Mikroskopia fluorescencyjna - Podstawy akwizycji obrazów mikroskopowych Cel ćwiczenia: Zaznajomienie się z podstawowymi funkcjami mikroskopu fluorescencyjnego umożliwiającymi trójwymiarową rekonstrukcję obrazów mikroskopowych

IZOLACJA KOMÓREK SZPIKU KOSTNEGO W CELU IDENTYFIKACJI WYBRANYCH POPULACJI KOMÓREK MACIERZYSTYCH TECHNIKAMI CYTOMETRYCZNYMI Ćwiczenie ma na celu: zapoznanie się z metodami izolacji komórek szpiku kostnego (SzK) oraz identyfikacji wybranych populacji komórek macierzystych z zastosowaniem technik cytometrycznych, w tym cytometrii przepływowej oraz obrazowej. Temat referatu: 1. Populacje komórek macierzystych obecnych w SzK. 2. Zasady analizy komórek w cytometrii przepływowej. Zakres materiału, który należy przygotować do ćwiczeń: 1.Zasada działania cytometru przepływowego. 2.Immunobarwienie komórek w celu ich analizy w mikroskopii fluorescencyjnej i cytometrii przepływowej. 3.Cechy charakterystyczne komórek macierzystych. Zalecana literatura: 1. Technical-Resources.html?icid=fr-flow-4 2. Lin KK, Goodell MA. Detection of hematopoietic stem cells by flow cytometry. Methods Cell Biol. 2011;103: Ratajczak MZ, Zuba-Surma EK, Machalinski B, Kucia M. Bone-marrow-derived stem cells--our key to longevity? J Appl Genet. 2007;48(4): Zuba-Surma EK, Ratajczak MZ. Analytical capabilities of the ImageStream cytometer. Methods Cell Biol. 2011;102: Klasyczna cytometria przepływowa Cytometria obrazowa

TRÓJWYMIAROWE OBRAZOWANIE KOMÓREK METODĄ MIKROSKOPII KONFOKALNEJ Ćwiczenie ma na celu: wykonanie trójwymiarowego obrazowania komórek metodą mikroskopii konfokalnej - porównanie z możliwościami mikroskopu fluorescecnyjnego szerokiego pola Tytuły referatów: 1. Sposób tworzenia obrazu w mikroskopie konfokalnym 2. Barwniki wykorzystywane w mikroskopii fluorescencyjnej. Zagadnienia do przygotowania: Podstawy mikroskopii optycznej, fluorescencyjnej i konfokalnej Zalecana literatura: Dobrucki J. Skaningowa, fluorescencyjna mikroskopia konfokalna. Mikrobiologia Medycyna 1996, 1(6) 34-38

Ćwiczenie ma na celu: Zbadanie dynamiki histonów wyznakowanych GFP w żywych komórkach metodą FRAP (Fluorescecne Recovery After Photobleaching) Tytuły referatów: 1. Rola białek histonowych w organizacji wysokorzędowych struktur chromatyny 2. Metoda FRAP (Fluorescence recovery after photobleaching) Zagadnienia do przygotowania: Podstawy mikroskopii konfokalnej, białka fluorescencyjne, struktura chromatyny BADANIE DYNAMIKI BIAŁEK JĄDROWYCH W ŻYWYCH KOMÓRKACH METODĄ MIKROSKOPII KONFOKALNEJ Zalecana literatura: 1. FRAP analysis of binding: proper and fitting. Brian L. Sprague and James G. McNally, Trends in Cell Biology, Volume 15, Issue 2, 84-91, 1 February Dynamic binding of histone H1 to chromatin in living cells. Misteli T, Gunjan A, Hock R, Bustin M, Brown DT. Nature Dec 14;408(6814):

KOLOKWIUM ZALICZENIOWE TEST WIELOKROTNEGO WYBORU: