Regulacja acetylacji histonu H4, podczas dojrzewania mejotycznego, w oocytach myszy

Prezentacja na temat: "Regulacja acetylacji histonu H4, podczas dojrzewania mejotycznego, w oocytach myszy"— Zapis prezentacji:

1

2 Regulacja acetylacji histonu H4, podczas dojrzewania mejotycznego, w oocytach myszy
TOMOHIKO AKIYAMA, JIN-MOON KIM, MASAO NAGATA, AND FUGAKU AOKI MOLEKULAR REPRODUCTION AND DEVELOPMENT 69: (2004) University of Tokyo, Chiba, Japan

3 Wstęp Oznaką rozpoczęcia dojrzewania mejotycznego jest rozpuszczenie osłonki jądrowej (zanik pęcherzyka zarodkowego) i kondensacja chromatyny Po 4-5 h zostaje wyrzucone I ciałko kierunkowe Po ukończeniu I podziału mejotycznego utworzone zostaje wrzeciono II podziału (metafaza II); w tym momencie dojrzewanie oocytu ponownie ulega zablokowaniu Rozpoczęcie dojrzewania mejotycznego spowodowane jest wzrostem aktywności czynnika MPF MPF jest białkowym kompleksem złożonym z kinazy p34 cdc2 (podjednostka katalityczna) i cykliny B (podjednostka regulatorowa) Podczas dojrzewania mejotycznego następuje aktywna synteza białek; nowo zsyntetyzowane białka biorą udział w dalszych przemianach mejotycznych. Jeśli synteza białek jest zatrzymana podczas dojrzewania mejotycznego, zatrzymana jest także synteza kinazy p34 cdc2; mejoza jest zatrzymana we wczesnym etapie

4 Wstęp c.d. Podczas dojrzewania mejotycznego oocytów myszy mają miejsce zmiany epigenetyczne (modyfikacje chromatyny), które przekładają się na fizyczną strukturę chromatyny i ekspresję genów; związane jest to z acetylacją i deacetylacją histonu H4 Acetylacja histonu H4 odgrywa ważną rolę w ekspresji genów, gdyż skutkuje zmianami w strukturze chromatyny, co przekłada się na zróżnicowaną ekspresję genów w oocytach myszy Podczas mejozy (ale nie mitozy) ma miejsce ogólna deacetylacja histonu H4 w Lys-12 (H4K12); deacetylaza histonu (HDACs) jest w stanie deacetylować histony, co wiąże się z zacieraniem epigenetycznych markerów aktywnych genów Acetylotransferaza histonów (HATs) jest inaktywowana specyficznie podczas mejozy

5 Materiały i metody 3 tygodniowe samice myszy;
47 h przed sekcją zastrzyk z PMSG Jajniki w pożywce Witten’s medium (Wm) + albumina 3 mg/ml Wykluto oocyty; usunięto komórki pęcherzykowe Selekcja; oocyty z pęcherzykiem zarodkowym (GV) (świeża pożywka Wm, cieplarka 38 st. C, 5% CO2) Doświadczenie 1 Doświadczenie 2 Doświadczenie 3

6 Doświadczenie 1 Obserwacja czasowych zmian w acetylacji histonu H4
Cel doświadczenia: Obserwacja czasowych zmian w acetylacji histonu H4 Materialy i metody: Inkubacja w pożywce Wm + DMSO Barwienie immunocytochemiczne; przeciwciała przeciwko zacetylowanemu H4K12; przeciwciała; FITC (zielony) Barwienie DNA przy użyciu DAPI (niebieski)

7 Doświadczenie 1 Wyniki: Wnioski: Histon H4K12 jest deacetylowany w momencie rozpoczęcia dojrzewania oocytu, czasowo acetylowany momencie ukończenia I podziału mejotycznego i wyrzucenia I cialka kierunkowego, ponownie deacetylowany w momencie rozpoczęcia II podziału mejotycznego

8 Doświadczenie 2 Cel doświadczenia: Czy kinaza p34 cdc2 bierze udział w deacetylacji histonu H4K12 Zbadanie roli kinazy p34 w utrzymaniu stanu deacetylacji H4K12 cdc2 podczas II podziału mejotycznego Czy roskowityna indukuje acetylację zdeacetylowanego histonu H4 podczas II podziału mejotycznego Materialy i metody: Oocyty GV, oocyty 8h, oocyty 11h Preinkubacja oocytów GV w pożywce Wm + IBMX + roskowityna lub WM + IBMX + DMSO (kontrola) Inkubacja oocytów (GV przez 4 h; 8 h przez 9 h; 11 h przez 6 h) w pożywce Wm + roskowityna lub Wm + DMSO Barwienie immunocytochemiczne; przeciwciała przeciwko zacetylowanemu H4K12; przeciwciała FITC (zielony) Barwienie DNA przy użyciu DAPI (niebieski) Doświadczenie przeprowadzono w 3 powtórzeniach

9 Doświadczenie 2 kinazy p34 cdc2
Wyniki: Wnioski: Deacetylacja histonu H4 podczas I i II podziału mejotycznego jest zależna od kinazy p34 cdc2 Kinaza p34 cdc2 jest niezbędna do deacetylacji histonu H4 podczas I i II podziału mejotycznego, ale nie jest niezbędna do utrzymania stanu deacetylacji podczas II podziału mejotycznego Kinaza p34 indukuje HDAC, a nie indukuje HAT

10 Doświadczenie 3 Cel doświadczenia: Zbadanie wpływu nowozsyntetyzowanych białek na utrzymanie deacetylacji histonu H4 podczas mejozy w oocytach myszy Zbadanie wpływu inhibicji syntezy białek na acetylację histonu H4 podczas II podziału mejotycznego Zbadanie wpływu CHX na syntezę białek w oocytach, w których deacetylacja już nastąpiła Materialy i metody: Oocyty GV, oocyty 8h, oocyty 11h Preinkubacja oocytów GV w pożywce Wm + IBMX + CHX lub WM + IBMX (kontrola) Inkubacja oocytów (GV przez 4 h; 8 h przez 9 h; 11 h przez 6 h) w pożywce Wm + CHX lub Wm Barwienie immunocytochemiczne; przeciwciała przeciwko zacetylowanemu H4K12; przeciwciała FITC (zielony) Barwienie DNA przy użyciu DAPI (niebieski) Doświadczenie przeprowadzono w 3 powtórzeniach

11 Doświadczenie 3 Wyniki: Wnioski: Nowozsyntetyzowane białka, podczas dojrzewania mejotycznego, są odpowiedzialne za utrzymanie stanu deacetylacji histonu H4K12 Jeśli synteza białek jest zatrzymana, następuje ponowna acetylacja histonu H4 Acetylotransferaza HAT jest inaktywowana przez nowozsyntetyzowane białka

12 Podsumowanie Podczas mejozy (ale nie mitozy) ma miejsce ogólna deacetylacja histonu H4 w Lys-12 (H4K12) Tylko deacetylaza histonu (HDACs) jest w stanie katalizować acetylację histonu H4 Acetylotransferaza histonów (HATs) jest inaktywowana specyficznie podczas mejozy Kinaza p34 cdc2 reguluje deacetylację histonu H4K12 podczas dojrzewania oocytów; indukuje deacetylację histonu H4K12 poprzez aktywację HDACs Nowozsyntetyzowane białka, podczas dojrzewania mejotycznego, są niezbędne do utrzymania stanu deacetylacji histonu H4K12, gdyż hamują działanie HAT Acetylacja histonu H4 odgrywa ważną rolę w ekspresji genów, gdyż skutkuje zmianami w strukturze chromatyny, co przekłada się na zróżnicowaną ekspresję genów w oocytach myszy Mejotyczna deacetylacja histonu H4K12 może być odpowiedzialna za przemodelowanie genomu oocytu w totipotencjalną zygotę

13 WNIOSEK Aktywność kinazy p34 cdc2 wywołuje deacetylację histonu H4 podczas dojrzewania mejotycznego w oocytach myszy; stan ten jest utrzymywany przez nowosyntetyzowane białka, które hamują działanie HAT podczas II podziału mejotycznego

14 KONIEC