Spektrometria mas MALDI-TOF/TOF Kazimierz Dąbrowski Katedra Chemii i Technologii Polimerów Wydział Chemiczny PW Warszawa, 16.04.2012

Najważniejsze odkrycia w historii spektrometrii mas Rok Odkrycie Nazwiska badaczy 1911 Zbudowanie pierwszego spektrometru mas Joseph John Thomson 1918 Opracowanie źródła jonów EI Arthur Jeffrey Dempster 1930 Zastosowanie spektrometrii mas w chemii organicznej R. Conrad 1942 Pierwszy sprzedany spektrometr mas Consolidated Energy Corporation 1946 Analizator czasu przelotu (TOF) William E. Stephens 1953 Spektrometr o podwójnym ogniskowaniu E. G. Johnson i A. O. Nier Kwadrupolowy analizator masy W. Paul i H. Steinwedel 1958 Połączenie spektrometru mas z chromatografem gazowym (GC) 1966 Sekwencjonowanie peptydów przy pomocy spektrometru mas K. Biemann, C. Cone, B. R. Webster i B. P. Arsenault Jonizacja Chemiczna (CI) B. Munson i F. H. Field 1968 Jonizacja przez Elektrorozpylanie (ESI) Malcom Dole 1981 Metoda jonizacji przez bombardowanie szybkimi atomami (FAB) Michael Barber 1983 Opracowanie metody jonizacji przez desorpcję laserem przy udziale matrycy – MALDI (Nagroda Nobla z Chemii w 2002 roku) Koichi Tanaka, Michael Karas i Franz Hillenkamp 1984 Pułapka jonowa G. C. Statford, P. E. Kelly, J. E. P. Syka, W. E. Reynolds i J. F. J. Todd Wykorzystanie elektrorozpylania (ESI) do analizy biopolimerów (Nagroda Nobla w 2002 roku) Gall Lydia (ZSRR), John Fenn (USA)

Podstawowe definicje Spektrometr masowy – instrument pozwalający na precyzyjny pomiar stosunku masy do ładunku (m/z) analizowanych substancji.  Rozdzielczość spektrometru – wartość liczbowa informująca o możliwości rozróżnienia na widmie masowym pików o zbliżonych masach. W przypadku pojedynczego piku wartość określająca dokładność oznaczenia masy cząsteczkowej (atomowej) substancji analizowanej. Jeśli spektrometr masowy w danym momencie analizy posiada rozdzielczość R=1000 istnieje możliwość rozróżnienia pików o m/z=1000 oraz m/z=1001. Dla izolowanego piku rozdzielczość definiuje jego szerokość połówkową, tzn. dla R=1000 i piku o m/z=1000 stosunek jego wysokości do szerokości w 0,5 wysokości wynosi co najmniej 10 (H/L0,5h>=10) Jon molekularny – jon obdarzony ładunkiem (ładunkami) powstający w wyniku fragmentacji próbki w źródle jonów Jon fragmentacyjny – jon powstały w wyniku spontanicznej fragmentacji substancji (np. podczas jonizacji metodą EI) lub uzyskany techniką tandemowej spektrometrii masowej. Dostarcza informacji o strukturze substancji analizowanej. Addukt - jon powstały poprzez przyłączenie do analizowanej substancji np. jonu sodowego Proteom - PROTEin complement of the genOME (ogół białek kodowanych przez genom) Dalton - jednostka masy, dokładnie odpowiada 1,0000 na skali mas atomowych Dekonwolucja - uzyskanie rzeczywistej masy substancji z widma pików wielokrotnie zjonizowanych Matryca - niskocząsteczkowe związki organiczne absorbujące promieniowanie lasera.

Najczęściej stosowane skróty EI (Electron Impact) - jonizacja elektronami MALDI (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization) - jonizacja laserem wspomagana matrycą ESI (Electrospray Ionization) - jonizacja przez rozpylanie w polu elektrycznym HPLC (High Performance Liquid Chromatography) - wysokosprawna chromatografia cieczowa) MS/MS (Tandem Mass Spectrometry) - tandemowa spektrometria masowa TOF  (Time of Flight Analyser) - analizator czasu przelotu PSD (Post Source Decay) - rozpad poza źródłem jonów m/z - stosunek wartości masy do liczby ładunków DIOS (Desorption/Ionization on Porous Silicon) - desorpcja/jonizacja na porowatym krzemie ICP  (Inductively Coupled Plasma) - jonizacja plazmą wzbudzoną indukcyjnie

Idea działania spektrometru mas źródło jonów – urządzenie, w którym następuje jonizacja cząsteczek przy użyciu różnorodnych technik, z których część prowadzi do pękania wiązań chemicznych na skutek czego dochodzi do ich podziału na mniejsze fragmenty. Inne techniki powodują tylko naładowanie cząsteczek bez ich fragmentacji, analizator – w którym wcześniej powstałe jony ulegają rozdziałowi na podstawie stosunku ich masy do ładunku. detektor – urządzenie "zliczające" jony napływające z analizatora.

Jonizacja próbki Twarda technika jonizacji Jon molekularny typu [M+.] Bogate widmo fragmentacyjne Łagodna technika jonizacji Pozorny jon molekularny [M+H]+ lub [M-H]- Brak fragmentacji

Jonizacja próbki cd.

Jonizacja próbki – lasery używane w technice MALDI Nitrogen laser: pro: well structured energy profile contra: slow (maximum 50Hz) Nd:YAG laser: pro: fast (up to 1000Hz) contra: Gaussian energy profile (non-structured) Smartbeam/Smartbeam II (modified Nd:YAG laser): pro: fast (up to 1000Hz) pro: well structured energy profile A. Holle, A. Haase, M. Kayser, J. Höhndorf, Journal of Mass Spectrometry, 41, 705-716 (2006)

Matryce Procesy zachodzące pod wpływem impulsu laserowego Absorpcja promieniowania głównie przez materiał matrycy. Odparowanie próbki na głębokość 2-3 l i wyrzucenie strumienia gazów prostopadle do jej powierzchni. Dysocjacja termiczna matrycy. Tworzenie jonów (głównie H+, Na+, K+). Reakcje jonów z badaną substancją i matrycą. Możliwe drogi: - dysocjacja termiczna z utworzeniem pary kation-anion - oderwanie elektronu - oderwanie bądź przyłączenie protonu - przyłączenie kationu bądź anionu

Matryce Pożądanymi cechami matrycy MALDI są: dość niska masa cząsteczkowa, co sprzyja łatwemu odparowaniu, ale wystarczająco duża, by odparowanie nie nastąpiło przed pomiarem, np. w czasie przygotowywania próbki; rozpuszczalność w rozpuszczalniku kompatybilnym z analitem; kwasowość, by ułatwić protonowanie cząsteczek analitu; obecność grup polarnych (hydrofilowych) w cząsteczce, co umożliwia rozpuszczanie matrycy w roztworach wodnych; stabilność w warunkach wysokiej próżni; wspomaganie jonizacji analitu; zdolność intensywnej absorpcji promieniowania UV lasera; zwykle wymóg ten spełnia związek, posiadający układ sprzężonych wiązań podwójnych C=C (dlatego często matrycami są pochodne aromatycznych kwasów karboksylowych, często nienasyconych, np. kwasu cynamonowego).

Matryce Sinapic acid Kwas 3-5-dimetoksy-4-hydroksy cynamonowy SINA proteiny Gentisic acid Kwas 2-5-dihroksy benzoesowy DHB peptydy 2-(4-Hydroxyphenylazo)benzoic acid Kwas 2-(4-hydroksyfenylazo)- benzoesowy HABA Peptydy, polimery Dithranol 1,8-Dihydroksyantracen-9(10H)-on DIT polimery α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid Kwas α-Cyano-4-hroksy cynamonowy CHCA, α-CHCA Peptydy, lipidy 2,4,6-Trihydroxyacetophenone 2,4,6-trihroksy acetofenon THAP oligonukleotydy

Tryb liniowy

Jak zwiększyć rozdzielczość? Tryb liniowy Jak zwiększyć rozdzielczość? Pulsed ion extraction – polepszenie ogniskowania jonów Optymalizacja przygotowania próbki – homogenizacja Użycie reflektronu

Optymalne przygotowanie próbki

Najczęściej stosowane metody nanoszenia próbki (analitu i matrycy) to: Metoda wysychającej kropli (dried droplet method) – jednowarstwowa: Przyrządza się osobno roztwór próbki i roztwór matrycy w tym samym rozpuszczalniku, lub – jeśli to niemożliwe – w dwóch kompatybilnych; niekiedy jeszcze używa się trzeciego roztworu - środka kationizującego, np. soli metalu (możliwe są różne rozpuszczalniki i stężenie). Wszystkie roztwory miesza się, a uzyskaną mieszaninę (0,5÷1 μl) umieszcza na płytce MALDI (MALDI target) i pozostawia do wyschnięcia na powietrzu. Wadą tej metody jest powolne wysychanie próbki, co może prowadzić do rozdzielenia kryształów matrycy próbki i soli kationizującej. Modyfikacjami tej metody są: zastosowanie odparowywania próżniowego lub odparowywanie w strumieniu ultraczystego azotu. W obu przypadkach otrzymuje się drobniejsze kryształy, lepszą rozdzielczość i powtarzalność oraz intensywność sygnałów. Metoda cienkiej warstwy (thin-layer method) – dwuwarstwowa: Roztwór matrycy w odpowiednim rozpuszczalniku (np. dla CHCA – roztwór nasycony w acetonie) nanosi się na płytkę MALDI i pozwala mu się wyschnąć, otrzymując cienką warstwę matrycy. Następnie 1 μl roztworu analitu nanosi się na wierzch uzyskanej powierzchni matrycy i suszy. Nanoszenie przez rozpylanie. Wariantami tej metody są: osadzanie strumieniem powietrza (air spray deposition) i osadzanie przez elektrosprej (electrospray sample depositon). Metoda mieszania ciał stałych (solid/solid sample preparation): Metoda polega na bardzo dokładnym mieszaniu drobno sproszkowanych matrycy i próbki (bez rozpuszczalnika) i prasowaniu całości w pastylkę. Stosuje się ją dla niektórych poliamidów, nierozpuszczalnych w pospolitych rozpuszczalnikach organicznych

Epot = zeU Ekin = 1/2mv2 zeU = 1/2mv2 v = (2zeU/m)1/2 t = L×(1/2eU)1/2×(m/z)1/2

Tryb reflektronu

Tryb reflektronu

Profil izotopowy

Profil izotopowy C41H69N13O14S [M+H]+: 1000.4880 [M+H]+: 1001.1409 Masa monoizotopowa Masa średnia

Kalibracja tof= tdelay + tacc + tdrift F = E q = M a d = a/2 tacc2 E = U/d q = z e tacc = d √(2m/Uze) tdrift= L √(m/2zeU) tof=tdelay + d √(2m/Uze) + L √(m/2zeU) tof=tdelay + (d √(2/Ue)+L √(1/2Ue)) × √(m/z) t = C0+C1√(m/z)

MALDI–ToF/ToF Ion path in TOF1 region (linear TOF) Ion path in TOF2 region (reflectorTOF) Ion source1 = MALDI ion source Ion source2 = LIFT re-acceleration cell PCIS = Timed ion gate PLMS = Post LIFT meta stable suppressor

MALDI–ToF/ToF

MALDI–ToF w badaniach polimerów Za pomocą MALDI można wyznaczyć następujące parametry polimerów: Mn, Mw, PD grupy końcowe polimeru budowę kopolimeru Montaudo G, J. Polym. Sci. A: Polym. Chem. 34, 1996, 439-447

A B C A9B2C A10B2C A8B2C A9BC A10BC A9B3C A8B3C A7B3C A11BC A8B4C A10C A7B4C A8B3C A9B2C A10BC A11C A8B4C A9B3C A10B2C A11BC A B C

Polimery polarne: poliwęglany, politlenki olefin  Polikwasy, poliestry, polimery słabo polarne (np. polistyren)  Polisacharydy, teflon, poliolefiny  mass discrimination effect

MALDI mass spectra of a poly(alkylthiophene) fractionated with acetone, hexanes, methylene chloride, THF, and chloroform Liu, J.; Loewe, R. S.; McCullough, R. D. Macromolecules1999, 32, 5777 -5785.

Wskazówki dla PT Klientów Badane mogą być związki stałe, ewentualnie ciecze nielotne (ciśnienie w komorze pomiarowej < 10-7 Torr). Do pomiaru używamy zazwyczaj 5 mg substancji. Próbki można dostarczać albo już odważone (proszę podać masę próbki), lub w większych pojemnikach. W razie tzw. wyższej konieczności do pomiaru wystarczy: substancji typu biologicznego (np. peptydu) 0,1 - 10 pmol, polimeru 50 - 200 pmol. Można również dostarczyć próbkę w postaci roztworu w dowolnym, ale koniecznie lotnym i niekorodującym rozpuszczalniku (prosimy o podanie stężenia roztworu !) Możliwy jest pomiar próbki nierozpuszczalnej, ale wówczas musi być ona w postaci możliwie drobnego proszku. Należy jednak podkreślić, że wyniki takiego pomiaru będą znacznie gorszej jakości, niż próbek rozpuszczalnych. Kategorycznie odmawiamy przyjmowania podejrzanych, dymiących cieczy zawierających stężone lotne kwasy (np. HCI, HNO3) oraz substancji korodujących typu POCI3, wolne aminy, fenole, merkaptany itd. Aby proces tworzenia jonów przebiegał możliwie wydajnie, próbka powinna być jak najczystsza. W szczególności nie powinna zawierać: nadmiaru soli nieorganicznych z grupy litowców i miedziowców, detergentów !!!, buforów, zwłaszcza fosforanowych, substancji silnie alkalizujących (reagują z matrycą), W przypadku polimerów, co do których zachodzi podejrzenie, że mogą zawierać frakcje znacznie różniące się masą cząsteczkową ( np. Mn = 1 500 i Mn = 30 000) niezbędne jest wstępne rozdzielenie próbki na frakcje. Prosimy o podanie spodziewanej masy cząsteczkowej, bądź przynajmniej zakwalifikowanie próbki do jednego z następujących przedziałów: < 5000; 5000-20000; > 20000 Do badanej próbki (lub grupy próbek) prosimy dołączyć „Zlecenie wykonania badania MALDI-ToF” (druk dostępny na stronie: www.ch.pw.edu.pl/~maldi )

Polecana literatura M. Karas, D. Bachmann, F. Hillenkamp; Analytical Chemistry, 57, 2935-2939 (1985) K. Tanaka, H. Waiki, Y. Ido, S. Akita, Y. Yoshida, T. Yoshida; Rapid Communications in Mass Spectrometry, 2, 151-153 (1988) R. C. Beavis, B. Chait, K.G. Standing; Rapid Communications in Mass Spectrometry, 3, 233-237 (1989) M. Karas, M. Glückmann, J. Schäfer; Journal of Mass Spectrometry, 35, 1-12, (2000) R. Zenobi and R. Knochenmuss; Mass Spectrometry Reviews, 17, 337-366 (1998) G. Montaudo, M. S. Montaudo, and F. Samperi, “ Mass Spectrometry of Polymers ”, ed. G. Montaudo and R. P. Lattimer, 2002 , CRC Press, Boca Raton, FL, 419.

Dziękuję za uwagę…