FIZYCZNA I CHEMICZNA BIAŁEK MODYFIKACJA FIZYCZNA I CHEMICZNA BIAŁEK

Denaturacja Denaturacją białka możemy przeprowadzić metodami fizycznymi lub chemicznymi, zmian w strukturze białka, które prowadza do mniejszej lub większej utraty aktywności biologicznej białka, przy czym jego struktura pierwszorzędowa nie zostaje zmieniona. Podczas denaturacji w dużej mierze zniszczeniu ulegają wiązania wodorowe, a w obecności odczynników redukcyjnych rozszczepieniu ulegają wiązania disiarkowego. Często denaturacja jest odwracalna i po usunięciu czynnika denaturującego białko wraca do pierwotnej postaci. Proces ten nazywa się renaturacją. Renaturacja jest też możliwa w przypadku denaturacji redukcyjnej. Podczas denaturacji zachodzą takie zmiany jak: zmniejszenie rozpuszczalności, może się w wyniku wyeksponowania nowych zjonizowanych grup przesunąć pH punktu izoelektrycznego. Rozwinięcie łańcucha może prowadzić do zwiększenia się lepkości, a także absorpcji w nadfiolecie. Obserwuje się też procesy agregacji i wytrącania, co jest związane z ze zmianą stopnia hydratacji i rozpuszczalności białek, a także zmianami w mostkach disiarkowych.

Fizycznymi metodami denaturacji białek są: Silne mieszanie, ogrzewanie, naświetlanie promieniami UV, rentgenowskimi lub działanie ultradźwiękami. Denaturacja chemiczna zachodzi pod wpływem takich związków jak: Roztwór mocznika (6-8 mol/dm3) lub guanidyny (4 mol/dm3), na skutek działania kwasów lub zasad (pH poniżej 3 lub powyżej 9), na skutek działania detergentów, roztworów soli ciężkich lub niektórych substancji organicznych takich jak: aceton, benzen, formaldehyd, benzyna. Poszczególne białka różnią się zdolnością do denaturacji.

Hydroliza Hydroliza białek polega na depolimeryzacji białek na poszczególne aminokwasy. Hydrolizę białek można przeprowadzać na trzy sposoby: pod wpływem kwasu, zasady lub enzymu. Hydroliza kwasowa polega na ogrzewaniu białka w roztworze HCl o stężeniu 2 mol lub roztworze H2SO4 o stężeniu 4 mol przez 18-24 h. Jednak w warunkach tych całkowitemu rozkładowi ulega tryptofan. Podczas hydrolizy zasadowej najczęściej ogrzewa się białko z NaOH o stężeniu 2 mol. Metoda ta jest praktycznie nie stosowana, ponieważ zupełnie niszczy argininę, cysteinę i treoninę. Najlepszą metodą hydrolizy białek jest hydroliza enzymatyczna, gdyż zniszczeniu nie ulegają żadne aminokwasy. Wadą tej metody jest powolność procesu, a co za tym idzie długi czas depolimeryzacji białka. Metoda hydrolizy enzymatycznej znalazła zastosowanie w określaniu sekwencji białek.

Reakcja plasteinowa Kazeinę enzymatyczną wykorzystuje się do przekształcania białek w reakcji polegającej na amidowym wiązaniu pożądanych reszt aminokwasów do peptydów hydrolizatu białkowego. Za pomocą reakcji plasteinowej można z białka o składzie ubogim z reszty aminokwasów niezbędnych wytworzyć produkt o większej wartości biologicznej. Można zmniejszyć gorzkość hydrolizatu przez „ukrycie” hydrofobowych aminokwasów w długich peptydach plastein. Stosując reakcję plasteinową katalizowaną papainą wobec dietylowego estru kwasu glutaminowego można około dwukrotnie zmniejszyć gorzkość hydrolizatu z krwinek.

Schemat technologiczny otrzymywanie plastein.

Reakcje katalizowane transglutaminazą Transglutaminaza katalizuje reakcję przeniesienia acylu, w której donorem jest grupa karboksyamidowa reszty glutaminy, a akceptorami mogą być pierwszorzędowe grupy aminowe w różnych związkach. Białko – (CH2)2 – CONH2 + H2N – R→transglutaminaza→ Białko – (CH2)2 – CONHR + NH3 Białko – (CH2)2 – CONH2 + H2N – (CH2)4 – Białko→transglutaminaza→ Białko – (CH2)2 – CONH(CH2)4 – Białko + NH3 Białko – (CH2)2 – CONH2 + H2O →transglutaminaza→ Białko – (CH2)2 – COOH + NH3 Jeśli akceptorem jest wolny aminokwas, następuje wzbogacenie białka o ten aminokwas, natomiast reakcja z grupą aminową reszty lizyny związanej w białku powoduje sieciowanie. Istnieje również możliwość deaminacji reszt glutaminowych, jeśli w nieobecności wolnych grup aminowych acylu jest woda.

Alkilowanie Reakcje z grupami karbonylowymi wykorzystuje się do modyfikowania białek. Aldehydy glutarowy i mrówkowy służą do wiązania enzymów na nośnikach. Traktowanie aldehydem mrówkowym zapobiega nadmiernej hydrolizie i deaminacji białek. W reakcjach z innymi związkami karbonylowymi wytwarzanie w swerze przez bakterie kwasu mlekowego tworzą się inne pochodne. W kąpielach do utwardzania włókien przy teksturowaniu biełek roślinnych stosuje się róne aldehydy, np. skrobię dialdehydową. Reakcje z aldehydami i cukrami redukującymi, w warunkach redukujących wykorzystuje się do alkilowania białek. Do alkilowania grup aminowych, hydroksylowych, imidazolowych, tiulowych i tioeterowych w resztach aminokwasów służą również reakcje z kwasami chlorowcooctowymi lub chlorowcoacetamidami.

Reakcje z polisacharydami Kowalencyjne wiązanie z odpowiednim polisacharydem może znacznie polepszyć właściwości funkcjonalne białek. Produkt reakcji Maillarda miedzy aminowymi grupami reszt lizyny i redukującą grupą polisacharydu otrzymywany podczas 2-tygodniowego inkubowania mieszaniny suszonej albuminy jaj z galaktomannanem ma właściwości jako emulgator niż wyjściowe białko. W kompleksach z agarem, furcelaranem, karageniną, kwasami alginowymi i karboksymetylocelulozą występują wiązania jonowe, natomiast obojętne polisacharydy tworzą z białkami wiązania wodorowe i hydrofobowe. Reakcje białek z polisacharydami wykorzystuje się do modyfikowania właściwości wielu przetworów żywnościowych, frakcjonowania i strącania białek z roztworów oraz do osadzania enzymów na nośnikach.

Acylowanie grup nukleofilowych w bialkach Szybkość acylowania zależy od własności czynnika acylującego i grupy nukleofilowej, od pH środowiska, konformacji acylowanego białka oraz od obecności inhibitorów. Najłatwiej acylują się pierwszorzędowe grupy aminowe, zwłaszcza aminowe grupy reszty lizyny, grupa fenolowa trozyny. Jako czynnik acylujący stosuje się bezwodniki kwasowe w słabo zasadowym środowisku lub inne pochodne dobrane do charakteru wprowadzanej grupy. Przy wyborze czynnika acylującego uwzględnia się szybkość i wydajność reakcji głównej. Poprzez acylowanie można zwiększyć lub zmniejszyć hydrofobowność białka, zmienić pI, wzbogacić cząsteczkę w reaktywne grupy funkcyjne lub pożądane reszty aminokwasowe włańcuchach bocznych, spowodować dodatkowe usieciowanie i zwiększyć zdolność wiązania jonów metali.

Reakcje z fosforanami Fosforany w różnych warunkach środowiska mogą reagować z białkami albo wpływać na właściwości białek przez oddziaływanie na inne składniki żywności. Maja duże zastosowanie jako dodatki do żywności, mogą służyć jako dodatek buforujący, podwyższający lub obniżający pH, wiążące jony metali, zwiększyć zdolność białek do emulgowania lipidów, stabilizujące białka w roztworach lub koagulujące, zwiększyć wodochłonność produktów mięsnych. Fosforany, zwłaszcza polifosforany, wiążą się elektrostatycznie z dodatnio naładowanymi resztami aminokwasów. Grupy hydroksylowe, dzięki wiązaniom wodorowym z cząsteczkami wody, tworzą warstwę hydratacyjną zapobiegającą koagulacji białek.

Modyfikacje potranslacyjne Obróbka proteolityczna odbywa się przy pomocy enzymów zwanych peptydazami, które są odpowiedzialne za cięcie łańcuchów polipeptydowych na końcu łańcucha (egzopeptydazy) lub w jego środku (endopeptydazy). Większość tych enzymów jest bardzo specyficzna - rozpoznają one miejsce cięcia na podstawie sekwencji aminokwasowej. Dobrym przykładem może posłużyć proinsulina, której pierwotny łańcuch polipeptydowy jest przecinany w określonych miejscach, następnie dwa produkty są łączone za pomocą "mostków" dwusiarczkowych.

Istnieje kilka innych przykładów obróbek proteolitycznych: - aktywacja białka, poprzez wycięcie niepotrzebnego fragmentu łańcucha polipeptydowego - usunięcie sekwencji liderowych (fragmentów łańcucha, które kierują białko do odpowiedniego przedziału komórkowego) - w przypadku poliprotein płaszcza niektórych wirusów - pocięcie na fragmenty, aktywuje każdy z otrzymanych fragmentów - rzadko występujący splicing polipeptydowy (podobnie jak obróbka preRNA) - wycinanie fragmentów ze środka łańcucha polipeptydowego - usuwanie pierwszego podstawnika (metioniny lub formylometioniny) występujące u prawie 50% wszystkich białek

II. N-acetylacja , N-formylacja, N-metylacja są rodzajami modyfikacji potranslacyjnych białek, w których następuje przyłączenie do N-końca łańcucha polipeptydowego grup acetylowych (acetylacja), metylowych (metylacja) lub metioniny (formylacja).

III. Glikozylacja - w tym procesie następuje dołączenie reszt cukrowcowych do białek (Np.: białek błonowych).

IV. Hydroksylacja - w przypadku aminokwasów proliny i lizyny - dołączenie grupy -OH V. Poli (ADP)-rybozylacja - dołączanie reszt adeninowych. VI. Fosforylacja - aktywacja białka poprzez dołączenie reszty fosforanowej przez specyficzne enzymy - kinazy. Bardzo powszechnie występujące wśród białek (Np.: czynniki transkrypcyjne).

VII. Defosforylacja - deaktywacja białka przez usunięcie reszty fosforanowej przez specyficzne enzymy - fosfatazy. Ubikwitynacja - (u organizmów Eukariotycznych) dołączenie innego białka - ubikwityny powoduje, że białko jest przeznaczone do degradacji. W procesie ubikwitynacji są usuwane (degradowane) białka źle sfałdowane, wadliwe oraz takie których "życie" dobiegło końca. Czas półtrwania białka jest zależny od rodzajów aminokwasów występujących na jego N-końcu.