Struktura i funkcja białek (I mgr) dr Katarzyna Śmietana kasia@protein.pl http://www.protein.pl/protein/downup/struk-funk/ Jeremy M. Berg, John L. Tymoczko, Lubert Stryer „Biochemia” Carl Branden, John Tooze “Introduction to Protein Structure”

Wykład 1 cztery główne typy funkcjonalne białek aminokwasy: wzory, właściwości, szczególne cechy kodu genetycznego, struktury II, III, IV rzędowe białek, mapa Ramachandrana, preferencje do występowania w określonych strukturach II-rzędowych, wiązanie peptydowe: cechy charakterystyczne, kąty, typy oddziaływań, odległość, przykłady, elementy stabilizujące struktury białek, efekt hydrofobowy (zwijanie białek, oddziaływanie białko-białko)

Wykład 2 motywy strukturalne i funkcjonalne (przykłady), domeny alfa, beta, alfa/beta, alfa + beta oligomeryzacja białek (typy, przykłady) rozpoznanie, komplementarność i centra aktywne, elastyczność białek, białka szkieletowe, domena PDZ, cechy charakterystyczne wiązania ligandów, struktura, specyficzność

Wykład 3 poziomy kontroli funkcji białek mechanizmy kierowania i regulacji białek kontrola funkcji białek: degradacja, kowalencyjne modyfikacje, proteoliza, lipidacja, metylacja, N-acetylacja, sumoilacja, nitrozylacja, fosforylacja białek, przykłady, wpływ na strukturę/aktywność molekularne przełączniki - cykl aktywności białek G, minimalna domena G, zasada działania, białka GAP, GEF, GDI – budowa i mechanizm działania, model działania mięśniowej miozyny i kinezyny kontrola funkcji białek przez modyfikacje kowalencyjne (fosforylacja, lipidacja, metylacja, N-acetylacja, sumoilacja, nitrozylacja) degradacja, proteoliza i składanie białek, czterostopniowy mechanizm splicingu białek

Wykład 4 Od sekwencji do funkcji: -- sekwencje homologiczne, dopasowanie sekwencyjne, motywy strukturalne i funkcjonalne (przykład), zasada 40% - mikromacierze DNA, żele 2D, Y2H - modelowanie homologiczne, profile-based threading, metody Rosetta, metoda GRID, THEMATICS - sekwencje kameleonowe Biosynteza białka - etapy, funkcje poszczególnych IF, EF i RF, ogólny opis struktury krystalicznej rybosomu, czym jest PTC, synteza wiązania peptydowego, tunel wyjściowy, L22 i SecM

Wykład 5 kinazy białkowe, struktura przestrzenna, mechanizm aktywacji i działania kinaz Src i układu Cdk2-cyklina A dwuskładnikowy mechanizm sygnalizacyjny bakterii przeciwciała, MHC I i II, receptor T: budowa, genetyczne i strukturalne podłoże różnorodności p53, ogólne informacje, budowa domeny oligomeryzacyjnej i wiążącej DNA, kluczowe reszty, białka natywnie niezwinięte struktura i funkcja bakteriorodopsyny, poryn, kanału potasowego, trzy typy białek fibrylarnych, kolagen, filamenty pośrednie, włókna amyloidowe: budowa i cechy szczególne, foldy metastabilne – priony, amyloidy i serpiny białka opiekuńcze podstawowa jednostka symetrii wirusów sferycznych, budowa wybranych wirusów

Wykład 6 ?

Białka stanowią aż 75% suchej masy tkanek miękkich naszego ciała z gr. proteios - pierwszorzędny, o największym znaczeniu białka są polimerami zbudowanymi z zestawu 20 różnych aminokwasów połączonych wiązaniami peptydowymi -> już dla stuaminokwasowego białka liczba możliwych sekwencji aminokwasowych (20100) przekracza 10130 znaczne zróżnicowanie właściwości fizykochemicznych poszczególnych reszt aminokwasowych umożliwia tworzenie przez łańcuchy białkowe bardzo różnorodnych struktur trójwymiarowych odznaczających się często dużym stopniem komplikacji – pozwala to na pełnienie przez białka tak wielu różnych funkcji różnorodność białek jest widoczna już w ich rozmiarach – znane są białka o masach od tysiąca do ponad miliona Da

Białka są najbardziej różnorodnymi i wielofunkcyjnymi cząsteczkami występującymi w komórce Wiązanie - różnorodność rozpoznawanych cząsteczek; komplementarność kształtu i oddziaływań polarnych Kataliza - przyspieszanie reakcji do 17 rzędów wielkości, odpowiednie ułożenie grup reaktywnych, stabilizacja stanu przejściowego, kataliza kwasowo-zasadowa

Molekularny przełącznik - zmiana konformacyjna pod wpływem pH lub wiązania liganda przełącza funkcję Białka strukturalne - specyficzna asocjacja podjednostek i białek pozwala na spontaniczne powstawanie nawet bardzo złożonych struktur

Wyróżniamy cztery poziomy organizacji struktury białek

Od właściwości łańcuchów bocznych zależy wkład różnych reszt aminokwasowych w zwijanie i funkcje białek w pH 7 końcowe grupy łańcucha polipeptydowego (aminowa i karboksylowa) są zjonizowane zaangażowane tylko w oddziaływania van der Waalsa unikanie wody i pakowanie się na siebie są podstawą efektu hydrofobowego Ala i Leu faworyzują powstawanie helisy w przeciwieństwie do proliny aromatyczny pierścień Phe czasami uczestniczy w słabych polarnych oddziaływaniach

mogą tworzyć wiązania wodorowe między sobą, z łańcuchem głównym i innymi cząsteczkami polarnymi (m.in. z wodą) niektóre dysponują ładunkiem (w zależności od pH i otoczenia)

- aa hydrofilowe tworzą wiązania wodorowe ze sobą, z łańcuchem głównym, z polarnymi związkami organicznymi i z wodą Glu i Asp  pKa 5 (ujemnie naładowane w pH 7), ale w otoczeniu hydrofobowym pKa może wzrosnąć powyżej 7 i wtedy służą jako donory protonu Lys  pKa 10 (w pH 7 dodatnio naładowana), ale w otoczeniu hydrofobowym może spaść poniżej 6 i wtedy Lys staje się akceptorem protonu

- His ma dwie grupy –N-H, każda o pKa około 6 - gdy jedna traci proton, pKa drugiej staje się większa niż 10 - gdy obie są uprotonowane His jest ujemnie naładowana (bardzo rzadko) - gdy jedna jest uprotonowana His jest neutralna i zdolna do przyjęcia bądź oddania protonu Arg jest prawie zawsze uprotonowana Grupa –SH cysteiny jest najsilniejszym nukleofilem

Ser, Thr, Gln i Asn są akceptorami i donorami protonu -- aa amfipatyczne najczęściej uczestniczą w tworzeniu interfejsów między elementami hydrofobowymi a polarnymi Tyr zwykle nie jonizuje w pH 7 (pKa=9). Grupa –OH jest donorem i akceptorem wiązania wodorowego, a aromatyczny pierścień Tyr uczestniczy w słabych oddziaływaniach polarnych Met jest najmniej polarna z grupy aa amfipatycznych, ale jej siarka jest często uczestniczy w oddziaływaniach z jonami metali

Sposób organizacji kodu genetycznego odzwierciedla wzajemne podobieństwa aminokwasów Więcej białek niż genów u Eukariontów: alternatywny splicing editing RNA

Częstość podstawień aminokwasowych w tym samym białku pochodzącym z różnych organizmów „conservative substitutions”

Tworzenie i hydroliza wiązania peptydowego Wiązanie kowalencyjne tworzone pomiędzy kwasem karboksylowym i grupą aminową dwóch α-aminokwasów z uwolnieniem jednej cząsteczki wody. Wiązania amidowe są bardzo stabilne w środowisku wodnym w pH bliskim 7. W komórce tworzenie i hydroliza wiązań peptydowych kontrolowane są enzymatycznie.

Rozciągnięty łańcuch polipeptydowy Rezonans – delokalizacja elektronów w obrębie wiązania peptydowego powoduje: -częściowy charakter wiązania podwójnego (CNO w jednej płaszczyźnie - dwa kąty torsyjne - ograniczona możliwość rotacji i konformacji; podwyższona stabilność) polarność wiązania peptydowego, moment dipolowy (możliwe oddziaływania)

Oddziaływania stabilizujące białko oddziaływania z wodą lub za jej pośrednictwem C=O i N-H we wnętrzu białka nie mogą tworzyć wiązań wodorowych z cząsteczkami wody, więc tworzą je między sobą prowadząc do powstania struktur II rzędowych i stabilizacji struktury

Ograniczenia steryczne określają możliwe typy struktury drugorzędowej Wykres Ramachandrana Prawie we wszystkich białkach łańcuch główny przyjmuje taką konformację, w której kąty torsyjne phi i psi powtarzają się, tworząc regularne wzory – elementy struktury drugorzędowej Ograniczenia steryczne określają możliwe typy struktury drugorzędowej

Zgięcie beta (beta/hairpin/reverse turn) najprostszy element struktury II-rzędowej -NH n+3 (n+2) -O Część grup C=O i N-H nie tworzy wiązań wodorowych w obrębie łańcucha, dlatego zgięcia występują najczęściej na powierzchni cząsteczki białka Obecność zgięć beta pozwala ograniczyć rozmiary białka i nadać mu bardziej zwartą strukturę

Helisa alfa – najpopularniejsza struktura II-rzędowa wiązania wodorowe pomiędzy C=O i N-H znajdującymi się blisko siebie w sekwencji n+4 3.6 reszty na skręt

Parametry elementów helikalnych n+4 n+3 n+5

Amfipatyczność helis alfa -łańcuchy boczne „wystają” co 100o -reszty oddalone od siebie o 3-4 aminokwasy grupują się po tej samej stronie helisy -helisy amfipatyczne stabilizują pakowanie helisa-helisa i często występują na powierzchni białka

Helisy zawierające reszty proliny Struktura kolagenu helisa lewoskrętna (Gly-X-Y)n gdzie X, Y to Pro, Pro-OH lub (rzadziej) Lys Helisy poliprolinowe wszystkie proliny w formie trans tworzą lewoskrętną helisę (3 reszty na skręt); motyw w białkach sygnalnych rozpoznawany przez domeny SH3

Struktury beta bardziej stabilna nie są eksponowane do rozpuszczalnika, najczęściej „przeplatane” helisami Silnie rozciągnięty, zwykle lekko skręcony łańcuch polipeptydowy odległość między resztami 3,3 Å Możliwość utworzenia struktury amfipatycznej

Kompleks Rap–Raf pakowanie helisy na równoległe włókno beta międzycząsteczkowa struktura beta jako interfejs oddziaływania białko-białko

Baryłka beta (b-barrel) -włókna beta, ze względu na konfiguracje L aminokwasów, mają tendencję do prawoskrętu -aminokwasy rozgałęzione na węglu beta (Val, Ile) łatwo akomodują się w strukturze beta (w porównaniu z gęsto upakowaną helisą) białko wiążące retinol z niepolarnym ligandem związanym we wnętrzu baryłki

Przewidywanie struktury drugorzędowej - trafność przewidywań zaledwie ok. 70% - najłatwiej określić położenie helis (tworzone dzięki oddziaływaniom reszt sąsiadujących ze sobą w sekwencji) - najtrudniej przewidzieć granice pętli i miejsca zgięć

Tworzenie struktury trzeciorzędowej Intermediaty zwijania (barnaza)

Efekt hydrofobowy -minimalizacja powierzchni hydrofobowej dostępnej dla rozpuszczalnika -zbliżenie polaryzowalnych grup hydrofobowych umożliwia powstanie między nimi oddziaływań van der Waalsa -tym samym „wciągniecie” polarnych grup C=O i N-H łańcucha głównego staje się siłą sprawczą powstania struktur drugorzędowych

Porównanie struktur TIM (izomerazy triozofosforanowej) i DHFR (reduktazy kw. dihydrofoliowego) -podobne elementy struktury drugorzędowej mogą tworzyć białka o całkiem różnych strukturach III° -wynika to ze sposobu łączenia elementów - występowania pętli lub zgięć

Pętle -pętle w białkach zwykle ulokowane są na powierzchni, eksponowane do rozpuszczalnika -ponieważ ich wkład w stabilizację struktury białka jest niewielki, w obrębie pętli łatwiej tolerowane są mutacje -dzięki temu pętle łatwo dostosowują się do powierzchni ligandów i często tworzą interfejsy oddziaływań białko-białko

Pierwsza powłoka hydratacyjna elastazy -cząsteczki wody ściśle związane z białkiem stanowią część jego struktury

Wnętrze zwiniętego białka - atomy we wnętrzu są upakowane prawie jak w ciele stałym kanały i szczeliny pozwalają jednak na ruch atomów i zapewniają elastyczność jeśli w rdzeniu znajdują się większe przestrzenie, to wypełnione są cząsteczkami wody, które mogą oddziaływać z okolicznymi grupami polarnymi

Motywy pakowania struktur helikalnych „ridges and grooves” cytochrom b562 ludzki hormon wzrostu

Symulowana struktura fragmentu dwuwarstwy lipidowej 20 x 1,5 Å - helisa 8-9 x 3.5 Å - włókno beta -otoczenie hydrofobowe powoduje, że wszystkie polarne grupy (w tym C=O i N-H łańcucha głównego) muszą zostać „zagrzebane” we wnętrzu białka – odwrotnie niż w środowisku wodnym

Fragment kompleksu cytochromu bc1 elementy przezbłonowe najczęściej są helikalne, ze względu na możliwość lokalnego utworzenia wiązań wodorowych w obrębie łańcucha głównego

Profil hydrofobowości białka DctB z Rhizobium meliloti

Struktura transportera FhuA Błonowe białka beta Struktura transportera FhuA włókno przezbłonowe = 8-9 reszt zwykle pod kątem => trudniejsze do przewidzenia zamknięte baryłki aby zaspokoić HB często tworzą kanały

Struktura bakteryjnego kanału potasowego homotetramer

Zorganizowane cząsteczki wody na eksponowanej powierzchni hydrofobowej rybonukleazy A Pojedyncze słabe oddziaływanie uwalnia około 4-13 kJ/mol energii swobodnej Zwinięte natywnie białko jest termodynamicznym kompromisem. Stabilność można zdefiniować jako utratę energii swobodnej, będącą sumą efektów entalpowych i entropowych. Dla większości białek różnica energii między stanem rozwiniętym a zwiniętym jest marginalna, około 21-42 kJ/mol.

Stabilność, denaturacja, termofilność marginalna stabilność dopuszcza duży stopień swobody (niezbędny do wzajemnego dopasowania podczas oddziaływań z ligandami czy katalizy) stan zdenaturowany rozpoznajemy po utracie aktywności biologicznej/biochemicznej lub zmianie sygnału np. dichroizmu kołowego denaturację można wymusić wysoką temperaturą oraz chemicznymi denaturantami (chlorowodorek guanidyny, mocznik, SDS), które współzawodniczą z polarnymi grupami białka o wiązania wodorowe stabilizację białek można uzyskać poprzez skracanie pętli, dodawanie mostków solnych itp.

stabilizacja przez mostki S-S Struktura BPTI stabilizacja przez mostki S-S -zwykle struktura białka jest stabilizowana przede wszystkim przez oddziaływania niekowalencyjne -w niektórych przypadkach istotną rolę mogą też pełnić oddziaływania kowalencyjne, np. tworzenie mostków disulfidowych -dotyczy to głównie białek zewnątrzkomórkowych, ponieważ warunki panujące w komórce są silnie redukujące

Fragment struktury subtylizyny stabilizacja przez koordynację metalu (Ca2+) -Kd wiązania metalu w zakresie od mM (bardzo słabe) do nM (bardzo mocne) -w koordynacji mogą uczestniczyć cząsteczki wody -w niektórych przypadkach białka strukturyzują się wyłącznie w obecności jonów metalu, a ich usunięcie prowadzi do denaturacji

Stabilizacja przez wiązanie kofaktora dotyczy miejsc aktywnych DaAT/pirydoksal mioglobina/hem+żelazo cytochrom c/hem+żelazo oksydaza poliaminowa/PQQ

Modyfikacje potranslacyjne wpływające na stabilność białka SUMOylation S-nitrosylation

Domeny strukturalne domeny tetrameryzacyjne domeny wiążące DNA Diagram tetrameru Lac represora wiążącego się do DNA białka fibrylarne/globularne domena – zwarty obszar w strukturze białka, zwykle (ale nie zawsze) tworzony przez ciągłą sekwencję aa, często posiadający zdolność zwijania się i funkcjonowania w sposób niezależny od reszty białka domeny mają nie więcej niż 250 aa (49% w granicach 51-150aa)

Domeny strukturalne struktura racemazy alaniny - nie wszystkie domeny budowane są przez ciągły odcinek sekwencji - rdzenie hydrofobowe domen białkowych

Domeny strukturalne monomer białka wielodomenowe ewoluowały przez fuzję genów kodujących pojedyncze białka im dawniej nastąpiła duplikacja, tym trudniej dostrzec podobieństwo (coraz więcej nagromadzonych mutacji) monomer (tioesteraza) homodimer (dehydraza tioestrowa)

Struktura gamma-krystaliny z soczewki oka podwójna duplikacja w obrębie tej samej domeny

Struktury syntazy Trp i dehydratazy galaktonianiu Podobna alfa/beta baryłka (żółta) mimo całkowitego braku pokrewieństwa oraz podobieństwa sekwencji czy funkcji obu białek -ograniczona liczba sposobów zwijania -domain fold – topograficzny układ elementów struktury drugorzędowej, charakterystyczny dla danej domeny

Diagram aranżacji domen w białkach zaangażowanych w sygnalizację komórkową -funkcjonowanie poszczególnych modułów może (ale nie musi) zależeć od ich kolejności w łańcuchu polipeptydowym => możliwe zamienianie i dokładanie domen -wyodrębniamy rodziny białek w zależności od architektury domenowej

Struktura reduktazy aldozy (redukcja, NADPH) i fosfotriesterazy (hydroliza, jon metalu) ten sam sposób zwinięcia – zupełnie inna funkcja i mechanizm katalizy

Struktura aminotransferaz katalizują tą samą reakcję brak podobieństwa sekwencji i struktury przestrzennej, z wyjątkiem bardzo podobnych miejsc aktywnych

Na następnym wykładzie: motywy strukturalne i funkcjonalne (przykłady), domeny alfa, beta, alfa/beta, alfa + beta oligomeryzacja białek (typy, przykłady) rozpoznanie, komplementarność i centra aktywne, elastyczność białek, białka szkieletowe, domena PDZ, cechy charakterystyczne wiązania ligandów, struktura, specyficzność