Dr Dietmar Petersohn Laboratorium Berliner Wasserbetriebe Pobieranie prób do badań bakteriologicznych – terminy, znaczenie, techniki Dr Dietmar Petersohn Laboratorium Berliner Wasserbetriebe

2006: DIN EN ISO 19458 Pobieranie prób do analiz mikrobiologicznych

Pobranie reprezentatywnych prób jest warunkiem właściwego przebadania wody do spożycia i jest tak samo istotne, jak analiza laboratoryjna Jest to szczególnie istotne w przypadku mikrobiologicznego badania wody do spożycia, ponieważ przekroczenie wartości progowych pociąga za sobą poważne skutki.

Prawdopodobieństwo popełnienia błędu próbobranie analiza ocena

§ 5 Wymagania mikrobiologiczne określone w niemieckiej ustawie o wodzie do spożycia (TrinkwV 2001)  W wodzie przeznaczonej do spożycia przez ludzi nie mogą znajdować się patogeny w rozumieniu ustawy o ochronie przed zakażeniami [Infektionsschutzgesetz] w stężeniach zagrażających zdrowiu ludzkiemu. W wodzie przeznaczonej do spożycia przez ludzi wartości graniczne parametrów mikrobiologicznych wymienionych w Załączniku 1, części 1 nie mogą zostać przekroczone.

TrinkwV 2001 Załącznik 1, część I: parametry mikrobiologiczne L.p. Parametr Wartość graniczna 1 E. coli 0/100 ml 2 Coliformy 3 Enterococci Załącznik 3: parametry wskaźnikowe L.p. Parametr Wartość graniczna 1 Clostridium perfringens 0 / 1 ml 2 Liczba kolonii w 20°C Liczba kolonii w wodzie zdezynfekowanej 100 / 1ml 20 / 1ml 3 Liczba kolonii w 36°C

Rutynowo badane będą następujące parametry: TrinkwV 2001 Załącznik 4 (§ 14 Abs.1) Zakres i częstotliwość badań parameterów mikrobiologicznych Rutynowo badane będą następujące parametry: 1. Routine investigations Escherichia coli (E. coli) Coliformy Clostridium perfringens (w tym zarodnie) (uwaga 2) liczba kolonii w temp. 22 °C i 36 °C Pseudomonas aeruginosa (uwaga 4)

2. Badania okresowe: Enterococci Legionella TrinkwV 2001 Załącznik 4 (§ 14 Abs.1) Zakres i częstotliwość badań parameterów mikrobiologicznych 2. Badania okresowe: Enterococci Legionella W zakres badań okresowych wchodzą również badania na obecność Legionella w instalacjach centralnego ogrzewania budynków, z których woda udostępniana jest publicznie, na mocy § 3.2 C

Podstawą uzyskania reprezentatywnego wyniku badania jest profesjonalne przeprowadzenie próbobrania Ważne!

Wybór właściwego punktu pobrania próby; warunki, które muszą być spełnione Czyste miejsce Kran w odpowiednim stanie Brak elementów plastikowych Bez zaworu Bez węża gumowego Bez dyszy Bez perlatora Bez elementów gumowych Bez uszczelnienia pakułami Bez wycieków Wypływ równomierny Miejsce do spuszczania wody (np. odpływ w podłodze) Odległość kranu od podłoża co najmniej 500 mm Wodomierz nie może być zainstalowany w studzience ze względów bezpieczeństwa Mała odległość dzieląca rurę od kranu

Miejsce pobrania reprezentatywnej próby: Należy uwzględnić wahania poziomie, pionowe i czasowe Należy unikać miejsc, w których warunki są niestabilne Należy wziąć pod uwagę niejednorodność systemu, tzn., nie we wszystkich miejscach woda ma jednakowe właściwości (miejsca zastoju wody, miejsca o zmniejszonym przepływie) Miejsce pobrania próby ma znaczenie – woda pobrana w pobliżu lustra ma inne właściwości, niż pobrana znad biofilmu W niektórych przypadkach (jeziora, baseny) stężenie może być wyższe w pobliżu lustra wody nawet 1000-krotnie, niż głębiej Jakość wody u wylotu zbiornika jest zasadniczo taka sama, jak zawartej w nim wody, ale może być zupełnie inna od jakości u wlotu do tegoż zbiornika

Instalacja z rurami elastycznymi

Przed pobraniem próby jasno wyznacza się cel badania Wyznaczenie celu (pytań) determinuje strategię oraz wykonanie próbobrania (w instalacjach wody do spożycia)

Zasady pobierania prób wody Próba reprezentatywna Kwalifikacje personelu Analiza po inspekcji na miejscu Czas między pobraniem, a analizą Transport Oznaczenia i protokół

Pobieranie prób do badania mikrobiologicznego Butelki szklane ze szklanymi korkami lub zamknięciami z folii aluminiowej, sterylne butelki plastikowe. Butelki przed użyciem sterylizowane co najmniej przez 1 godz. w temp. 170 ± 10°C lub w temp. 121 ± 3 °C przez 15 min. w autoklawie) Trwałość – ok. 4 tygodni Deaktywacja czynnika utleniającego: Na każde 100 ml próby – 0,1 ml 1,8% roztworu sterylizowanego tiosiarczanu sodu (wg DIN EN ISO 19458 4.2.3.) - brak wpływu na próbę / nie ulega zniszczeniu podczas sterylizazji -

Sterylizacja Jeżeli nie ma innej możliwości – otwarte butelki zanurza się na 30 min. we wrzącej wodzie Natychmiast po wygotowaniu butelki się opróżnia, zamyka korkami wygotowywanymi razem z nimi i pakuje w materiał taki, jak np. folia aluminiowa Sterylizacja w autoklawach: zamknięcia poluzowane – po sterylizacji dokręcane; stosując korki szklane nie wolno zapomnieć o paskach folii aluminiowej

Pobieranie prób do badań mikrobiologicznych Objętość próby zależy od zakresu badań Butelki wypełnia się do 5/6 objętości Podczas próbobrania zachować najwyższą czystość Butelki do pobierania prób ze zbiorników muszą być sterylne na zewnątrz i wewnątrz (chronić folią aluminiową lub torbą plastikową) Właściwy opis próby i protokół z próbobrania

Przykład protokołu z próbobrania Przeznaczenie Data pobrania Czas pobrania Miejsce pobrania T. °C Odczyt ClO2 Obliczona wartość ClO2 H2O2 ClO2 Uwagi

Miejsca pobierania prób Krany Hydranty p.-poż. Zbiorniki Studnie Baseny

!Nowość ISO 19458 Jakość wody – pobieranie prób do badań mikrobiologicznych Pobieranie prób z kranów może służyć różnym celom: Określeniu jakości wody w głównej sieci wodociągowej (za co odpowiedzialna jest firma wodociągowa); Próby pobierane w celu oceny jakości wody w głównym wodociągu (przypadek a)) najlepiej pobierać ze specjalnych kranów (umieszczonych w instalacji domowej) znajdujących się blisko głównego wodociągu, czystych, bez dodatkowych urządzeń i możliwych do zdezynfekowania przez opalanie lub inną odpowiednią metodą. Do oceny jakości w głównym wodociągu można pobrać również wodę ze zwykłych kranów konsumentów (dot. przypadku a)), jeżeli istnieje możliwość ich zdezynfekowania przez opalanie, jednak w przypadku niejasnych wyników należy wziąć pod uwagę sieć domową jako potencjalne źródło zanieczyszczenia.

!Nowość ISO 19458 Jakość wody – pobieranie prób do badań mikrobiologicznych Pobieranie prób z kranów może służyć różnym celom: Poznanie jakości wody spożywanej przez konsumentów – jej stanu w momencie dostarczenia do kranu – (który to stan może ulec zmianie pod wpływem instalacji w budynku); Sytuacja opisana w przypadku b) jest preferowaną metodą oceny jakości wody do spożycia z uwzględnieniem wpływu instalacji domowej. W tym przypadku nie zawsze istnieje dostęp do kranów możliwych do zdezynfekowania przez opalanie i dlatego należy rozważyć zastosowanie innych metod (podchloryny, 70% alkohol izopropylowy)

!Nowość ISO 19458 Jakość wody – pobieranie prób do badań mikrobiologicznych Pobieranie prób z kranów może służyć różnym celom: Poznanie jakości wody spożywanej przez konsumentów, tzn. w takim stanie, w jakim wypływa ona z (potencjalnie zanieczyszczonego) kranu Sytuacja opisana w przypadku c) jest metodą oceny jakości wody stosowaną w wyjątkowych sytuacjach, np. w przypadku wystąpienia chorób. Zależnie od celu, konieczne lub niewłaściwe jest wykonywanie następujących czynności: - usuwanie zamontowanych urządzeń; - dezynfekcja kranu - spuszczanie wody.

!Nowość ISO 19458 Jakość wody – pobieranie prób do badań mikrobiologicznych Punkt pobrania próby Miejsce pobrania próby musi charakteryzować się reprezentatywnością, a wszelkie wahania pionowe, poziome lub czasowe muszą być precyzyjnie zidentyfikowane zgodnie z ogólnymi zaleceniami ISO 5667-1 oraz ISO 5667-2, z wzięciem pod uwagę dodatkowych aspektów szczególnych dla mikrobiologii. Należy unikać punktów pobierania prób o niestabilnych warunkach, należy wziąć pod uwagę również niejednorodność systemu hydraulicznego. W badaniach nad skutecznością dezynfekcji należy wybrać punkt pobrania próby tak, aby zapewnić zakończenie reakcji PRZYKŁAD sposobu, w jaki niejednorodność systemu może wpłynąć na wyniki podano poniżej. Próby pobrane spod powierzchni i z powierzchni nie są równoważne; próba pobrana spod powierzchni może również zostać „zanieczyszczona” podczas przechodzenia przez film znajdujący się na powierzchni. W niektórych przypadkach (jeziora, baseny) stężenie w filmie na powierzchni może być 1000-krotnie wyższe, niż pod powierzchnią.

!Nowość ISO 19458 Jakość wody – pobieranie prób do badań mikrobiologicznych PRZYKŁAD sposobu, w jaki niejednorodność systemu może wpłynąć na wyniki podano poniżej. Jakość wody w różnych miejscach wodociągu może być różna ze względu na występowanie ślepych rur oraz fragmentów, gdzie przepływ jest zmniejszony, w szczególności w przypadku sieci, do których woda dostarczana jest z 2 źródeł. Jakość wody u wylotu dobrze przemieszanego zbiornika jest zasadniczo taka sama, jak zawartej w nim wody, ale może być zupełnie inna od jakości u wlotu do tegoż zbiornika.

!Nowość ISO 19458 Jakość wody – pobieranie prób do badań mikrobiologicznych Transport Czas pomiędzy pobraniem próby, a analizą w laboratorium powinien być jak najkrótszy. W przypadku wody do spożycia najlepiej, aby analiza rozpoczęła się tego samego dnia roboczego. Schładzanie prób – najlepiej (5 ± 3) °C — podczas transportu (np. w przenośnych lodówkach, z zastosowaniem pojemników/worków z lodem), chyba że konkretna norma mówi inaczej. Należy unikać zamrażania (za wyjątkiem wirusów). Chronić próby przed światłem słonecznym. W przypadku prób przewożonych przez dłużej niż 8h, należy monitorować i zapisywać temperaturę. Warunki transportu muszą być udokumentowane. Należy zwrócić szczególną uwagę, aby: pojemniki (worki) z lodem nie stykały się bezpośrednio z próbami, ponieważ może to doprowadzić do ich zamrożenia; dobrać liczbę, objętość i umiejscowienie pojemników/worków z lodem do liczby, masy i początkowej temperatury prób. udokumentować procedurę wymaganą podczas dłuższego transportu prób (>8h). Próby wody gorącej i zimnej należy przewozić osobno.

DIN EN ISO 19458

Załącznik B

Źródło problemu - perlator - w złym stanie - odkręcić

Tworzenie się biofilmu w systemach dystrybucji wody do spożycia Tworzenie się biofilmu zależy od dostępności związków biodegradowalnych. Związki takie mogą być obecne w wodzie (AOC, NH4+) lub uwalniane z materiałów syntetycznych i osadów. Żelazo, mangan oraz inne związki również gromadzą się w biofilmie. Skutkiem erozji jest akumulacja osadów w rurach zaślepionych. Większość bakterii obecnych w systemach wodociągowych pochodzi z biofilmu i osadów. Pierwotniaki i bezkręgowce żerują na biofilmie i osadach. Dlatego też tworzenie się biofilmu jest kluczowe w procesie zanieczyszczenia wtórnego. woda materiał Związki biodegradowalne

zakład produkcyjny kran konsumenta OSAD WODA Bakterie Bezkręgowce

Definicja biofilmu jest to trójwymiarowa kolonia bakterii zawartych w macierzy zewnątrzkomórkowych polimerów (egzopolisacharydów) wykazujących zdolność adhezji do wilgotnych powierzchni stałych oraz do siebie nawzajem. Biofilm zawierać może składniki abiotyczne i nieorganiczne utrzymywane również przez polimery zewnątrzkomórkowe. Biofilm stać się może żerowiskiem i schronieniem dla organizmów jednokomórkowych (ameb, orzęsków, wiciowców), przy czym w warunkach optymalnych cysty (formy przetrwalnikowe, spory) tych organizmów obecne są stale w biofilmie.

Biofilm znajduje się praktycznie we wszystkich wodociągach używanych do wody do spożycia. Jego tworzenie się rozpoczyna się zazwyczaj bezpośrednio po napełnieniu nowej lub zmodernizowanej instalacji wodą. Biofilm tworzy się na wewnętrznych powierzchniach rur, złączek itp., a jego wzrost pobudzany jest dodatkowo zabrudzeniami osadzającymi się podczas transportu oraz na placu budowy, smarami, produktami korozyjnymi, kurzem, fragmentami pakuł, martwymi bakteriami etc. Jest to doskonałe podłoże dla pionierskich mikroorganizmów.

Pojawienie się i rozwój biofilmu jest tym łatwiejszy, im więcej bakterii znajduje się w wodzie na wejściu do wodociągu; zależy również od obecności substancji odżywczych w wodzie i powierzchniach mających z nią styczność, korzystnej temperatury w systemie (> 20°C), długości okresu stagnacji wody oraz rodzaju powierzchni, na której biofilm się osadza.

Zastosowanie środka dezynfekującego oraz procedury dezynfekcyjnej w stosunku do urządzeń wodociągowych musi odbywać się przy założeniu, że zdezynfekowana będzie nie tylko objętość wody wypełniająca system, ale że dezynfekcja obejmie wszystkie mające kontakt z wodą i pokryte biofilmem wewnętrzne powierzchnie instalacji wodociągowej w budynku (rury, łączniki, uszczelki, armatura, etc.); tylko wtedy procedura przyniesie zamierzony skutek zmniejszenia liczby bakterii.

Ponadto należy wziąć pod uwagę, że mikroorganizmy wchodzące w skład biofilmu zachowują się odmiennie w reakcji na procedurę dezynfekcyjną. Cechę tę wykorzystywano do określenia skuteczności procedury dezynfekcji.

Należy zapobiegać rozwojowi biofilmu! Bakterie w biofilmie: Pojawianie się i rozwój biofilmu możliwy jest już w obecności niewielkich ilości materii organicznej. Obecność biofilmu umożliwia rozwój patogenom W biofilmie są one w znacznym stopniu chronione przed dezynfekcją Z biofilmu pojedyncze komórki mogą przedostawać się do wody do spożycia Należy zapobiegać rozwojowi biofilmu!

Ogólne: Należy zagwarantować, że próba jest aseptyczna, próbobranie przeprowadzać czystymi rękoma Chronić próbę przed wiatrem Korek szklany nie może się z NICZYM zetknąć (palce, podłoże, torba, zęby) Wypełnić butelkę w 5/6 Natychmiast zamknąć butelkę. Wody z tej butelki nie używa się do pomiaru temperatury, ani innych parameterów (pH, konduktywność)

Woda ze studni i gruntowa Cele analizy mogą być różne: 1. aby określić jakość wody gruntowej (Próbę pobiera się do sterylnej (wewnątrz i na zewnątrz!) butelki o znanej masie po wypompowaniu takiej ilości wody – około 30 godz. – aby wodę ze studni zastąpiła woda gruntowa; dopuszczalne jest również pompowanie pompą głębinową)

Woda ze studni i gruntowa 2. w celu zbadania jakości wody studziennej (postępować podobnie, jak powyżej, bez długiego pompowania) 3. w celu zbadania jakości wody faktycznie używanej do spożycia (pobieranie z kranu pompy w warunkach sterylnych lub czerpiąc wodę ze studni bezpośrednio butelką)

Zbiorniki / wody powierzchniowe baseny / cysterny Pobierać próby czerpakiem w miejscach, gdzie głębokość wody waha się w granicach 1 – 1,5 m 20 – 30 cm pod powierzchnią wody Butelka sterylna wewnątrz i na zewnątrz W przypadku zbiorników zaopatrzonych w krany: Sterylizacja przez opalanie Wyraźne oznakowanie

Zbiorniki / wody powierzchniowe baseny / cysterny Uwzględnić wszystkie zmiany pionowe poziome w czasie

Zbiorniki / wody powierzchniowe baseny / cysterny Urządzenie (czerpak) do pobierania sterylnych prób z otwartych basenów i wód powierzchniowych

Pobieranie prób z hydrantów

Hydrant pożarowy: Próby z systemu wodociągowego pobierać można również przez hydranty. Urządzenia tego typu muszą być utrzymywane w czystości Jeżeli jest to konieczne, przed pobraniem próby przeprowadzić dezynfekcję Przez nagłą zmianę ciśnienia podczas otwarcia hydrantu osady i biofilm mogą zostać naruszone

Hydrant pożarowy: Podczas procedury przepłukiwania efekt uzyskany dzięki gwałtownemu wypływowi wody jest pożądany. Przed pobraniem próby strumień wody musi zostać ograniczony; należy spuszczać wodę do osiągnięcia faktycznej jakości z wodociągu, bez osadów.

Hydrant pożarowy z kranem do pobierania prób: zawór główny kran do pobierania prób z zaworem kulowym podłączenie węża strażackiego zawór regulacyjny butelka na próbę wąż spustowy podstawa hydrantu

Wiarygodność badań Związki chemiczne w wodzie rozłożone są równomiernie Mikroorganizmy w wodzie rozłożone są nierównomiernie Mikroorganizmy mają tendencję do tworzenia zwartych grup

„Woda jest najważniejsza dla tych, którzy chcą być zdrowi” Hipokrates, 460 p.n.e.

Dziękuję Państwu za uwagę!