Cryptosporidia i Giardia Analityka i wyzwania Dr Katrin Luden Dr. K. Luden Cryptosporidia i Giardia Analityka i wyzwania Dr Katrin Luden Warsaw March 2009 1

Dr. K. Luden Cryptosporidium C. parvum pasożyty wewnątrzkomórkowe wywołujące biegunkę Zakażenie wywoływane przez oocysty (5 µm) zawierające sporozoity (dawka wywołująca zakażenie 1-10 oocysts) Przenoszone drogą fekalną lub przez zanieczyszczoną wodę Rezerwuar: kręgowce, np. bydło, konie, kozy, owce, psy, koty, ptaki… Czas inkubacji 7-10 (1-12) dni Możliwe wydalanie z odchodami przez okres kilku tygodni Do tej pory brak specyficznej terapii Środki profilaktyczne: podgrzewanie do 60°C przez 30 min. lub gotowanie Warsaw March 2009 2

Giardia G. lamblia pasożyt jelita cienkiego wywołujący biegunkę Dr. K. Luden Giardia G. lamblia pasożyt jelita cienkiego wywołujący biegunkę Zakażenie wywołują cysty (7x 12 µm) zawierające trofozoity Przenoszone drogą fekalną lub przez zanieczyszczoną wodę Rezerwuar: ludzie, kręgowce? Czas inkubacji 3 - 25 (1-14) dni Istnieje terapia lekowa Może trwać w stadium bezobjawowym przez lata Warsaw March 2009 3

Dyrektywa w sprawie wody do spożycia 98/83/EC Dr. K. Luden Dyrektywa w sprawie wody do spożycia 98/83/EC Załącznik I Część C: Parametry wskaźnikowe Clostridium perfringens Uwaga 2: Tego parametru nie trzeba mierzyć, chyba że woda pochodzi z wód powierzchniowych lub znajduje się pod ich wpływem. W przypadku niezgodności z wartością parametryczną, dane Państwo Członkowskie musi zbadać dostawę w celu zapewnienia, że nie ma potencjalnego zagrożenia dla zdrowia ludzkiego wynikającego z obecności mikroorganizmów chorobotwórczych np.: cryptosporidium. Państwa Członkowskie muszą włączyć wyniki tych badań do sprawozdań, które przedkładają na mocy art. 13 ust. 2. Warsaw March 2009 4

Niemiecka ustawa o wodzie do spożycia Dr. K. Luden Niemiecka ustawa o wodzie do spożycia Załącznik I Część C: Parametry wskaźnikowe Clostridium perfringens Tego parametru nie trzeba mierzyć, chyba że woda pochodzi z wód powierzchniowych lub znajduje się pod ich wpływem. W przypadku niezgodności z wartością graniczną, dane Państwo Członkowskie musi zbadać system zaopatrzenia w celu zapewnienia, że nie ma potencjalnego zagrożenia dla zdrowia ludzkiego wynikającego z obecności mikroorganizmów chorobotwórczych np.: cryptosporidium. Właściwe władze informują Federalne Ministerstwo Zdrowia przez najwyższe władze kraju związkowego. Warsaw March 2009 5

Wartości graniczne i metody Dr. K. Luden Wartości graniczne i metody Cryptosporidium Giardia Ujęty w dyrektywie i ustawie Nie ujęty w dyrektywie, ani w ustawie Brak wartości parametrycznych Brak metody Ocena ryzyka ??? Metody stosowane rutynowo w USA i ZK: US EPA 16223 oraz ZK (DWI), podobne do ISO 15553 Warsaw March 2009 6

Dr. K. Luden ISO 15553 Jakość wody – wyodrębnianie z wody i identyfikacja oocyst Cryptosporidium oraz cyst Giardia Zakres: brak identyfikacji gatunku, brak oznaczania żywotności, brak oznaczania zjadliwości Zasada: Stężanie z wody przez filtrację i elucję, po której następuje powolne wirowanie Oczyszczanie metodą separacji immunomagnetycznej (immunomagnetic separation - IMS) Wykrywanie metodą epifluorescencji oraz mikroskopii w systemie kontrastu interferencyjno – różniczkowego (differential interference contrast - DIC) Warsaw March 2009 7

Dr. K. Luden ISO 15553 Próbobranie: 10 do 1.000 l wody – do pojemników transportowych lub filtrowanie na miejscu przepływ oraz ciśnienie mogą być ograniczone przez dobór filtra Około 95-100 % pasożytów zatrzymywane jest na filtrze Stopień odzysku całej metody podlega znaczącym wahaniom (10-80 %), w zależności od matrycy Mętność jest istotna (przyleganie oocyst/cyst do cząsteczek?) Warsaw March 2009 8

Stężanie Pompy perystaltyczne zwykłe Dr. K. Luden Stężanie Pompy perystaltyczne zwykłe Przepływomierz (określenie ilości oocyst / objętość) Kapsuła filtra Envirocheck, Filta Max Miejsce pobrania (woda surowa, uzdatniona, kranowa) Odpływ Warsaw March 2009 9

Dr. K. Luden Stężanie Kapsuła filtra jest płukana, a bufor elucyjny zbierany w probówkach do wirowania Wirowanie Zlanie supernatantu Oczyszczanie / IMS Warsaw March 2009 10

Dr. K. Luden Stężanie Kapsuła filtra jest płukana, a bufor elucyjny zbierany w probówkach do wirowania Wirowanie Zlanie supernatantu Oczyszczanie / IMS Warsaw March 2009 11

Oczyszczanie metodą IMS Dr. K. Luden Oczyszczanie metodą IMS Separacja immunomagnetyczna Element paramagnetyczny Przeciwciała cryptosporidium Oocysta Y Y Kompleks oddzielany od cząstek stałych przy pomocy magnesów i przemywania Warsaw March 2009 12

Dr. K. Luden IMS Warsaw March 2009 13

Oczyszczanie metodą IMS / Wykrywanie Dr. K. Luden Oczyszczanie metodą IMS / Wykrywanie Separacja immunomagnetyczna Barwienie przeciwciałami połączonymi z izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC) Rozbicie kompleksu przez zastosowanie kwasu (wysokiej temperatury) Y Y Wykrywanie przy pomocy mikroskopu Warsaw March 2009 14

Cryptosporidium oocysta Dr. K. Luden Wykrywanie Mikroskopia epifluorescencyjna i DIC (Differential interference contrast – kontrast interferencyjno - różniczkowy) Zalecane jest barwienie DAPI w celu wykrycia jąder sporozoitów trofozoitów Przy pomocy DIC można wykryć wewnętrzne cechy morfologiczne Cryptosporidium oocysta 4-6 µm Giardia cysta 8-12 µm x 7-10 µm Warsaw March 2009 15

Wyzwania Etap analizy Wyzwanie Filtracja Dr. K. Luden Wyzwania Etap analizy Wyzwanie Filtracja Retencja ~ 100 %, ale odzysk jedynie 10-80 % Elucja Strata oocyst / cyst przez niecałkowity transfer Wirowanie Strata oocyst / cyst przez naruszenie granulatu Oczyszczanie metodą IMS Straty na etapie przemywania Przeciwciała specyficzne jedynie dla niektórych gatunków Wykrywanie metodą epifluorescencji Fluorescencja tła cząstek stałych Niełatwe do identyfikacji ze względu na pospolity kształt Warsaw March 2009 16

Charakterystyka wyników Dr. K. Luden Charakterystyka wyników Odzysk, granica wykrywalności, efekt matrycy Metoda niezbyt dobrze odróżnia komórki żywe od martwych i zakaźne od niezakaźnych Zawsze konieczna analiza kilku próbek: próba porażona (kontrola pozytywna, oznaczenie odzysku) próba naturalna wiarygodna kontrola negatywna (wykluczenie zanieczyszczenia krzyżowego sprzętu, ocena fluorescencji tła…) Koszt ~ 400 € (kapsuła filtra, barwienie, sprzęt, czas) Warsaw March 2009 17

Sytuacja w Niemczech Kontrole jakości: badanie biegłości? Dr. K. Luden Sytuacja w Niemczech Kontrole jakości: badanie biegłości? W Niemczech niewiele laboratoriów stosuje tę metodę (np. Federalna Agencja Środowiska) Brak badań biegłości (jak przesyłać próby wody o pojemności 10 l?) Większość wody do spożycia pochodzi ze starych wód podziemnych: źródło bardzo bezpieczne Nie ma konieczności przeprowadzania tej analizy, ale również bark możliwości szybkiego wdrożenia metody na poziomie laboratorium Warsaw March 2009 18

Kryptosporydioza w Dolnej Saksonii Dr. K. Luden Kryptosporydioza w Dolnej Saksonii Liczba zgłoszonych przypadków Warsaw March 2009 19

Kryptosporydioza w Dolnej Saksonii Dr. K. Luden Kryptosporydioza w Dolnej Saksonii Dolna Saksonia – 7,9 miliona mieszkańców 1 zgłoszony incydent na 50 000 mieszkańców na rok 90% wody do spożycia z chronionych wód podziemnych („stara” woda podziemna) Wody powierzchniowe mają wpływ na 10% wody do spożycia Warsaw March 2009 20

Zagadnienia dla służb ochrony zdrowia Dr. K. Luden Zagadnienia dla służb ochrony zdrowia W przypadku kryptosporydiozy rodzaj dostaw wody (publiczne, prywatna studnia, wody podziemne, woda uzdatniona…) rodzaj obszaru (wiejski, gospodarstwo rolne…) / kontakt z obornikiem... kontakt z osobą cierpiącą na biegunkę wizyta w gospodarstwie hodowlanym kontakt z cielętami, zwierzętami domowymi, mlekiem niepasteryzowanym plac zabaw pływalnia publiczna Warsaw March 2009 21

Potencjalne zanieczyszenie pochodzenia fekalnego Dr. K. Luden Potencjalne zanieczyszenie pochodzenia fekalnego Wystąpienie pasożytów możliwe, ale brak możliwości przeprowadzenia analizy laboratoryjnej Ważne informacje o rodzaju dostaw wody jako podstawa oceny ryzyka Technika pobierania prób / punkt pobrania System dystrybucji (rury, etc.) Typ dystrybuowanej wody / ujęcia Uzdatnianie (firma wodociągowa, poszczególne etapy) Zlewnia Plan bezpieczeństwa wodnego / system wielobarierowy Warsaw March 2009 22

Dziękuję Państwu za uwagę! Dr. K. Luden Dziękuję Państwu za uwagę! Warsaw March 2009 23