Dr Dietmar Petersohn Laboratorium Berliner Wasserbetriebe Pobieranie prób do badań bakteriologicznych – terminy, znaczenie, techniki Dr Dietmar Petersohn Laboratorium Berliner Wasserbetriebe

2006: DIN EN ISO 19458 Pobieranie prób do analiz mikrobiologicznych

Pobranie reprezentatywnych prób jest warunkiem właściwego przebadania wody do spożycia i jest tak samo istotne jak analiza laboratoryjna Dotyczy to szczególnie pobierania prób do mikrobiologicznego badania wody do spożycia, ponieważ przekroczenie wartości progowych pociąga za sobą poważne skutki.

Prawdopodobieństwo popełnienia błędu próbobranie analiza ocena

§ 5 Wymagania mikrobiologiczne określone w niemieckiej ustawie o wodzie do spożycia (TrinkwV 2001)  W wodzie przeznaczonej do spożycia przez ludzi nie mogą znajdować się patogeny w rozumieniu ustawy o ochronie przed zakażeniami [Infektionsschutzgesetz] w stężeniach zagrażających zdrowiu ludzkiemu. W wodzie przeznaczonej do spożycia przez ludzi wartości graniczne parametrów mikrobiologicznych wymienionych w Załączniku 1, części 1 nie mogą zostać przekroczone.

TrinkwV 2001 Załącznik 1, część I: parametry mikrobiologiczne L.p. Parametr Wartość graniczna 1 E. coli 0/100 ml 2 Coliformy 3 Enterococci Załącznik 3: parametry wskaźnikowe L.p. Parametr Wartość graniczna 1 Clostridium perfringens 0 / 1 ml 2 Liczba kolonii w 20°C Liczba jednostek koloniotwórczych w wodzie zdezynfekowanej 100 / 1ml 20 / 1ml 3 Liczba kolonii w 36°C

Systematycznie badane będą następujące parametry: TrinkwV 2001 Załącznik 4 (do § 14, ustęp 1) Zakres i częstotliwość badań parametrów mikrobiologicznych Systematycznie badane będą następujące parametry: 1. Badania systematyczne Escherichia coli (E. coli) Coliformy Clostridium perfringens (w tym zarodnie) (uwaga 2) Liczba kolonii w temp. 22 °C i 36 °C Pseudomonas aeruginosa (uwaga 4)

2. Badania okresowe: Enterococci Legionella TrinkwV 2001 Załącznik 4 (do § 14, ustęp 1) Zakres i częstotliwość badań parametrów mikrobiologicznych 2. Badania okresowe: Enterococci Legionella W zakres badań okresowych wchodzą również badania na obecność Legionella w instalacjach centralnego ogrzewania budynków, z których woda udostępniana jest publicznie, na mocy § 3 Nr 2 Podpunkt C

profesjonalne przeprowadzenie próbobrania Podstawą uzyskania reprezentatywnego wyniku badania jest profesjonalne przeprowadzenie próbobrania

Wybór właściwego punktu pobrania próby Warunki zewnętrzne – czyste miejsce Bez wykopów budowlanych Kran w odpowiednim stanie Brak elementów plastikowych Bez zaworu Bez węża gumowego Bez dyszy Bez perlatora Bez elementów gumowych, bez uszczelnienia pakułami Bez nieszczelnych zaworów Wypływ równomierny Miejsce do spuszczania wody (np. odpływ w podłodze) Odległość kranu od podłoża co najmniej 500 mm Wodomierz nie może być zainstalowany w studzience ze względów bezpieczeństwa Światło Mała odległość dzieląca rurę od kranu

Miejsce pobrania reprezentatywnej próby: Należy uwzględnić wahania poziome, pionowe i czasowe Należy unikać miejsc, w których warunki są niestabilne Należy wziąć pod uwagę niejednorodność systemu, tzn., nie we wszystkich miejscach woda ma jednakowe właściwości (miejsca zastoju wody, miejsca o zmniejszonym przepływie) Miejsce pobrania próby ma znaczenie – woda pobrana w pobliżu lustra ma inne właściwości, niż próba „skażona” błoną powierzchniową W niektórych przypadkach (jeziora, baseny) stężenie może być nawet 1000-krotnie wyższe w błonie powierzchniowej wody niż głębiej Jakość wody u wylotu zbiornika jest zasadniczo taka sama jak wewnątrz niego, ale może być zupełnie inna od jakości u wlotu do tegoż zbiornika

Przyczyny zanieczyszczeń wody do spożycia Dostęp nieoczyszczonej wody Nowe odcinki wodociągów Prace w sieci Niedozwolone połączenia z urządzeniami wody użytkowej Osady w wodociągach i instalacjach wody do spożycia Osady korozyjne Środki przetwórcze u odbiorcy Nieodpowiednie użycie Niewystarczające oczyszczenie Substancje, z którymi woda wchodzi w kontakt Substancje wydzielające węgiel organiczny

Możliwe czynniki wpływające na zmianę cech mikrobiologicznych wody do picia w instalacjach wody do spożycia Stare urządzenia gospodarstwa domowego (zmywarki, pralki) bez armatury zabezpieczającej Niezamieszkałe mieszkania w domach wielorodzinnych, których instalacje nie zostały w odpowiedni sposób opróżnione i zamknięte Obszary stagnacji Prace przy instalacjach wody do spożycia w ostatnich tygodniach (?), miesiącach (?) (firma instalacyjna/zezwolenie?) Armatura upustowa (rodzaj armatury, perlator, ramię odchylne, przedłużenie przez wąż gumowy, natrysk ręczny)

Zawór upustowy wody (pralki, zmywarki itp.) Kombinacja armatur wg DIN 3266 Część 1 RV element zabezpieczający przed przepływem powrotnym RB napowietrzacz

Zabezpieczenie przed przepływem powrotnym otwarty przy upuście wody otwarty zamknięty przy braku upustu wody i przy przepływie powrotnym zamknięty

Instalacja z rurami elastycznymi

Przed pobraniem próby jasno wyznacza się cel badania Wyznaczenie celu (pytań) determinuje strategię oraz wykonanie próbobrania (w instalacjach wody do spożycia)

Zasady pobierania prób wody Próba reprezentatywna Kwalifikacje personelu Ustalenie po inspekcji na miejscu Czas między pobraniem a analizą Transport Oznaczenia i protokół

Pobieranie prób do badania mikrobiologicznego Butelki szklane ze szklanymi korkami, nakrętkami lub zamknięciami z folii aluminiowej, sterylne butelki plastikowe. Butelki przed użyciem sterylizowane co najmniej przez 1 godz. w temp. 170 ± 10°C lub w temp. 121 ± 3 °C przez 15 min. w autoklawie) Przechowywanie / czyste miejsce – ok. 4 tygodni / data sterylizacji Dezaktywacja czynnika utleniającego: Na każde 100 ml próby – 0,1 ml 1,8% roztworu sterylizowanego tiosiarczanu sodu (wg DIN EN ISO 19458 4.2.3.) - brak wpływu na próbę / nie ulega zniszczeniu podczas sterylizacji -

Sterylizacja Jeżeli nie ma innej możliwości – otwarte butelki zanurza się na 30 min. we wrzącej wodzie Natychmiast po wygotowaniu butelki się opróżnia, zamyka korkami wygotowywanymi razem z nimi i pakuje w materiał taki jak np. folia aluminiowa Sterylizacja w autoklawach: zamknięcia poluzowane – po sterylizacji dokręcane; stosując korki szklane nie wolno zapomnieć o paskach folii aluminiowej

Pobieranie prób do badań mikrobiologicznych Objętość próby zależy od zakresu badań Butelki wypełnia się do 5/6 objętości Podczas próbobrania zachować najwyższą czystość Butelki do pobierania prób batometrycznych ze zbiorników muszą być sterylne na zewnątrz oraz wewnątrz (chronić folią aluminiową lub torbą plastikową) Właściwy opis próby i protokół z próbobrania

Przykład protokołu z próbobrania Przeznaczenie Data pobrania Czas pobrania Miejsce pobrania T. °C Odczyt ClO2 Obliczona wartość ClO2 H2O2 ClO2 Uwagi

Miejsca pobierania prób Krany Hydranty przeciwpożarowe Baseny Studnie Zbiorniki

Przeprowadzenie próbobrania Podstawowe ustalenia dotyczące poprawnego pobierania próbek wody przeznaczonej do spożycia zapisane są w DIN 38402, w części 19. Dalsze wskazówki zawarte zostały w DIN 38411, w części 1 (Przygotowanie do mikrobiologicznego przebadania próbek wody) W punkcie 5.3.1. DIN 38411 część 1 „Pobieranie próbek z kranów” zamieszczone następujące uwagi: „Kran należy odkręcić, po czym zakręcić i powtórzyć czynność kilkukrotnie w celu wypłukania ewentualnych osadów. Następnie należy tak długo opalać kran, aż przy jego odkręcaniu będzie słychać wyraźne syczenie. Krany, z których woda nie płynie gładkim strumieniem, krany nieszczelne, krany wyposażone w dysze, węże itp. Lub takie, na których zamontowano regulację strumienia wody nie nadają się do pobrania próby wody”. Źródło: „Wasserinformation Nr.62” Komisja DVGW Mikrobiologia wody przeznaczonej do spożycia

Pobieranie prób z kranów Kilkakrotnie odkręcić i zakręcić kran w celu wypłukania cząstek. Dokładnie opalić kran od ujścia do połączenia ze ścianą Spuścić wodę strumieniem grubości ołówka przez ok. 5 min aż do uzyskania stałej temperatury Pobrać próbę w sterylnych warunkach. Wypełnić butelkę do ok. 5/6 objętości.

„Próbobranie decyduje o wyniku badań“ Wymagania wynikające z wytycznej UE i ustawy TrinkwV 2001 według DIN EN ISO 19458 (2005)  Stopień 1: Kontrola jakości wody docierającej do domu użytkownika: Dezynfekcja kranu; należy spuścić wodę aż do otrzymania stałej temperatury Stopień 2: Kontrola jakości wody docierającej do użytkownika: Dezynfekcja kranu; należy tylko przez chwilę spuścić wodę, aby wykluczyć wpływ dezynfekcji Stopień 3: Kontrola jakości wody w sytuacjach nagłych: Bezpośrednie pobranie wody bez dezynfekcji i wcześniejszego spuszczania

Przeprowadzenie próbobrania w różnych celach Lp. Jakość wody Usunięcie zainstalowanych urządzeń lub wkładek Dezynfekcja Płukanie 1. W instalacji głównej Tak 2. W kranie Nie / a (minimalne) 3. W sytuacji użycia Nie a = krótkie płukanie w celu zrównoważenia wpływu dezynfekcji

!Nowość ISO 19458 Jakość wody – pobieranie prób do badań mikrobiologicznych Pobieranie prób z kranów może służyć różnym celom: Określeniu jakości wody w głównej sieci wodociągowej (za co odpowiedzialna jest firma wodociągowa); Próby pobierane w celu oceny jakości wody w głównym wodociągu (przypadek a)) najlepiej pobierać ze specjalnych kranów (umieszczonych w instalacji domowej) znajdujących się blisko głównego wodociągu, czystych, bez dodatkowych urządzeń i możliwych do zdezynfekowania przez opalanie lub inną odpowiednią metodę. Do oceny jakości w głównym wodociągu można pobrać również wodę ze zwykłych kranów konsumentów (dot. przypadku a)), jeżeli istnieje możliwość ich zdezynfekowania przez opalanie, jednak w przypadku niejasnych wyników należy wziąć pod uwagę sieć domową jako potencjalne źródło zanieczyszczenia.

!Nowość ISO 19458 Jakość wody – pobieranie prób do badań mikrobiologicznych Pobieranie prób z kranów może służyć różnym celom: Poznanie jakości wody spożywanej przez konsumentów – jej stanu w momencie dostarczenia do kranu – (który to stan może ulec zmianie pod wpływem instalacji w budynku); Sytuacja opisana w przypadku b) jest preferowaną metodą oceny jakości wody do spożycia z uwzględnieniem wpływu instalacji domowej. W tym przypadku nie zawsze istnieje dostęp do kranów możliwych do zdezynfekowania przez opalanie i dlatego należy rozważyć zastosowanie innych metod (podchloryny, 70% alkohol izopropylowy)

!Nowość ISO 19458 Jakość wody – pobieranie prób do badań mikrobiologicznych Pobieranie prób z kranów może służyć różnym celom: Poznanie jakości wody spożywanej przez konsumentów, tzn. w takim stanie, w jakim wypływa ona z (potencjalnie zanieczyszczonego) kranu Sytuacja opisana w przypadku c) jest metodą oceny jakości wody stosowaną w wyjątkowych sytuacjach, np. w przypadku wystąpienia chorób. Zależnie od celu, konieczne lub niewłaściwe jest wykonywanie następujących czynności: - usuwanie zamontowanych urządzeń; - dezynfekcja kranu - spuszczanie wody.

!Nowość ISO 19458 Jakość wody – pobieranie prób do badań mikrobiologicznych Punkt pobrania próby Miejsce pobrania próby musi charakteryzować się reprezentatywnością, a wszelkie wahania pionowe, poziome lub czasowe muszą być precyzyjnie zidentyfikowane zgodnie z ogólnymi zaleceniami ISO 5667-1 oraz ISO 5667-2, z wzięciem pod uwagę dodatkowych aspektów szczególnych dla mikrobiologii. Należy unikać punktów pobierania prób o niestabilnych warunkach, należy wziąć pod uwagę również niejednorodność systemu hydraulicznego. W badaniach nad skutecznością dezynfekcji należy wybrać punkt pobrania próby tak, aby zapewnić zakończenie reakcji. PRZYKŁAD sposobu, w jaki niejednorodność systemu może wpłynąć na wyniki podano poniżej. Próby pobrane spod powierzchni i z powierzchni nie są równoważne; próba pobrana spod powierzchni może również zostać „zanieczyszczona” podczas przechodzenia przez film znajdujący się na powierzchni. W niektórych przypadkach (jeziora, baseny) stężenie w filmie na powierzchni może być 1000-krotnie wyższe, niż pod powierzchnią.

!Nowość ISO 19458 Jakość wody – pobieranie prób do badań mikrobiologicznych PRZYKŁAD sposobu, w jaki niejednorodność systemu może wpłynąć na wyniki podano poniżej. Jakość wody w różnych miejscach wodociągu może być różna ze względu na występowanie ślepych rur oraz fragmentów, gdzie przepływ jest zmniejszony, w szczególności w przypadku sieci, do których woda dostarczana jest z dwóch źródeł. Jakość wody u wylotu dobrze przemieszanego zbiornika jest zasadniczo taka sama, jak zawartej w nim wody, ale może być zupełnie inna od jakości u wlotu do tegoż zbiornika.

!Nowość ISO 19458 Jakość wody – pobieranie prób do badań mikrobiologicznych Transport Czas pomiędzy pobraniem próby, a analizą w laboratorium powinien być jak najkrótszy. W przypadku wody do spożycia najlepiej, aby analiza rozpoczęła się tego samego dnia roboczego. Schładzanie prób – najlepiej (5 ± 3) °C — podczas transportu (np. w przenośnych lodówkach, z zastosowaniem pojemników/worków z lodem), chyba że konkretna norma mówi inaczej. Należy unikać zamrażania (za wyjątkiem wirusów). Chronić próby przed światłem słonecznym. W przypadku prób przewożonych przez dłużej niż 8h, należy monitorować i zapisywać temperaturę. Warunki transportu muszą być udokumentowane. Należy zwrócić szczególną uwagę, aby: pojemniki (worki) z lodem nie stykały się bezpośrednio z próbami, ponieważ może to doprowadzić do ich zamrożenia; dobrać liczbę, objętość i umiejscowienie pojemników/worków z lodem do liczby, masy i początkowej temperatury prób. udokumentować procedurę wymaganą podczas dłuższego transportu prób (>8h). Próby wody gorącej i zimnej należy przewozić osobno.

DIN EN ISO 19458

Załącznik B

Źródło problemu - perlator - w złym stanie - odkręcić

Tworzenie się biofilmu w systemach dystrybucji wody do spożycia Tworzenie się biofilmu zależy od dostępności związków biodegradowalnych. Związki takie mogą być obecne w wodzie (AOC, NH4+) lub uwalniane z materiałów syntetycznych i osadów. Żelazo, mangan oraz inne związki również gromadzą się w biofilmie. Skutkiem erozji jest akumulacja osadów w rurach zaślepionych. Większość bakterii obecnych w systemach wodociągowych pochodzi z biofilmu i osadów. Pierwotniaki i bezkręgowce żerują na biofilmie i osadach. Dlatego też tworzenie się biofilmu jest kluczowe w procesie zanieczyszczenia wtórnego. woda materiał Związki biodegradowalne

zakład produkcyjny kran konsumenta OSAD WODA Bakterie Bezkręgowce

Definicja biofilmu jest to trójwymiarowa kolonia bakterii zawartych w macierzy zewnątrzkomórkowych polimerów (egzopolisacharydów) wykazujących zdolność adhezji do wilgotnych powierzchni stałych oraz do siebie nawzajem. Biofilm zawierać może składniki abiotyczne i nieorganiczne utrzymywane również przez polimery zewnątrzkomórkowe. Biofilm stać się może żerowiskiem i schronieniem dla organizmów jednokomórkowych (ameb, orzęsków, wiciowców), przy czym w warunkach optymalnych cysty (formy przetrwalnikowe, spory) tych organizmów obecne są stale w biofilmie.

Biofilm znajduje się praktycznie we wszystkich wodociągach używanych do wody do spożycia. Jego tworzenie się rozpoczyna się zazwyczaj bezpośrednio po napełnieniu nowej lub zmodernizowanej instalacji wodą. Biofilm tworzy się na wewnętrznych powierzchniach rur, złączek itp., a jego wzrost pobudzany jest dodatkowo zabrudzeniami osadzającymi się podczas transportu oraz na placu budowy, smarami, produktami korozyjnymi, kurzem, fragmentami pakuł, martwymi bakteriami etc. Jest to doskonałe podłoże dla pionierskich mikroorganizmów.

Pojawienie się i rozwój biofilmu jest tym łatwiejszy, im więcej bakterii znajduje się w wodzie na wejściu do wodociągu; zależy również od obecności substancji odżywczych w wodzie i powierzchniach mających z nią styczność, korzystnej temperatury w systemie (> 20°C), długości okresu stagnacji wody oraz rodzaju powierzchni, na której biofilm się osadza.

Zastosowanie środka dezynfekującego oraz procedury dezynfekcyjnej w stosunku do urządzeń wodociągowych musi odbywać się przy założeniu, że zdezynfekowana będzie nie tylko objętość wody wypełniająca system, ale że dezynfekcja obejmie wszystkie mające kontakt z wodą i pokryte biofilmem wewnętrzne powierzchnie instalacji wodociągowej w budynku (rury, łączniki, uszczelki, armatura, etc.); tylko wtedy procedura przyniesie zamierzony skutek zmniejszenia liczby bakterii.

Ponadto należy wziąć pod uwagę, że mikroorganizmy wchodzące w skład biofilmu zachowują się odmiennie w reakcji na procedurę dezynfekcyjną. Cechę tę wykorzystywano do określenia skuteczności procedury dezynfekcji.

Należy zapobiegać rozwojowi biofilmu! Bakterie w biofilmie: Pojawianie się i rozwój biofilmu możliwy jest już w obecności niewielkich ilości materii organicznej. Obecność biofilmu umożliwia rozwój patogenom W biofilmie są one w znacznym stopniu chronione przed dezynfekcją Z biofilmu pojedyncze komórki mogą przedostawać się do wody do spożycia Należy zapobiegać rozwojowi biofilmu!

Ogólne: Należy zagwarantować, że próba jest aseptyczna, próbobranie przeprowadzać czystymi rękoma Chronić próbę przed wiatrem Korek szklany nie może się z NICZYM zetknąć (palce, podłoże, torba, zęby) Wypełnić butelkę w 5/6 Natychmiast zamknąć butelkę. Wody z tej butelki nie używa się do pomiaru temperatury ani innych parameterów (pH, konduktywność)

Woda ze studni i gruntowa Cele analizy mogą być różne: 1. aby określić jakość wody gruntowej (Próbę pobiera się do sterylnej (wewnątrz i na zewnątrz!) butelki o znanej masie po wypompowaniu takiej ilości wody – około 30 godz. – aby wodę ze studni zastąpiła woda gruntowa; dopuszczalne jest również pompowanie pompą głębinową)

Woda ze studni i gruntowa 2. w celu zbadania jakości wody studziennej (postępować podobnie, jak powyżej, bez długiego pompowania) 3. w celu zbadania jakości wody faktycznie używanej do spożycia (pobieranie z kranu pompy w warunkach sterylnych lub czerpiąc wodę ze studni bezpośrednio butelką)

Zbiorniki / wody powierzchniowe / baseny / cysterny Pobierać próby czerpakiem w miejscach, gdzie głębokość wody waha się w granicach 1 – 1,5 m 20 – 30 cm pod powierzchnią wody Butelka sterylna wewnątrz i na zewnątrz W przypadku zbiorników zaopatrzonych w krany: Sterylizacja przez opalanie Wyraźne oznakowanie

Zbiorniki / wody powierzchniowe / baseny / cysterny Uwzględnić wszystkie zmiany pionowe poziome w czasie

Zbiorniki / wody powierzchniowe baseny / cysterny Urządzenie (czerpak) do pobierania sterylnych prób z otwartych basenów i wód powierzchniowych

Pobieranie prób z hydrantów

Hydrant pożarowy: Próby z systemu wodociągowego pobierać można również przez hydranty. Wszystkie urządzenia tego typu wykorzystywane w rutynowych i specjalnych badaniach (np. przy nowych odcinkach sieci, po przepłukiwaniu sieci, w przypadkach zakłóceń) muszą być utrzymywane w czystości Jeżeli jest to konieczne, przed pobraniem próby przeprowadzić dezynfekcję Przez nagłą zmianę strumienia i ciśnienia wody podczas otwarcia hydrantu osady i biofilm z systemu wodociągowego mogą zostać naruszone

Hydrant pożarowy: Podczas procedury przepłukiwania pożądany jest efekt uzyskany dzięki gwałtownemu wypływowi wody. Przed pobraniem próby strumień wody musi zostać ograniczony; należy spuszczać wodę do osiągnięcia faktycznej jakości z wodociągu, bez osadów.

Hydrant pożarowy z kranem do pobierania prób: zawór główny kran do pobierania prób z zaworem kulowym podłączenie węża strażackiego zawór regulacyjny butelka na próbę wąż spustowy podstawa hydrantu

Wiarygodność badań Związki chemiczne w wodzie rozłożone są równomiernie Mikroorganizmy w wodzie rozłożone są nierównomiernie Mikroorganizmy mają tendencję do tworzenia zwartych grup

Sprawdzenie środków dezynfekujących Testy „Lovibond” Cyfrowe urządzenia pomiarowe

Procedury przy przekroczonych normach mikrobiologicznych Raportowanie Płukanie (0,7 – 1 m/s) Dezynfekcja Powtórzenie Ewentualna próba porównawcza Badanie przyczyn

Próbobranie odbiegające od w/w standardów ma miejsce wtedy, gdy należy wziąć pod uwagę skażenie w punkcie pobrania lub zastaną wodę. Kran nie jest wtedy opalany, a perlatory itp. nie podlegają usunięciu. (np. podejrzenie zakażenia pseudomonami lub legionellami)

Próbobranie / Legionelle Pomiar temperatury podczas próbobrania, ewentualnie także maksymalna osiągalna temperatura oraz czas potrzebny do jej uzyskania Doświadczony personel do ustalenia miejsca (dokładne informacje o badanym systemie) Obowiązują przepisy zawarte w arkuszu roboczym DVGW W 551 w połączeniu z ISO 11731 Co najmniej 2-3 punkty próbobrania w celu otrzymania orientacyjnego wyniku Próbobranie bezpośrednio z armatury bez użycia środków pomocniczych i bez opalania Spuścić 5-10 litrów (ewentualna różnica przy prysznicach – uwaga w protokole) Sterylne pojemniki szklane – tworzywa sztuczne nieodpowiednie? Transport bez schłodzenia

„Woda jest najważniejsza dla tych, którzy chcą być zdrowi” Hipokrates, 460 p.n.e.

Dziękuję Państwu za uwagę!