Badanie transportu w biomatrycach lipidowych z zastosowaniem spektroskopii NMR Dorota Michalak Praca magisterska napisana pod okiem dr hab. Marcina Pałysa pod opieką dr hab. Wiktora Koźmińskiego, prof. UW w Pracowni Teorii i Zastosowania Elektrod Wydziału Chemii Uniwersytetu Warszawskiego Dyfuzja ma fundamentalne znaczenie dla procesów biologicznych, a badać to zjawisko można m.in. Jądrowym Rezonansem Magnetycznym (NMR), wykorzystanym w pracy. Istnieją proste układy modelowe o właściwościach podobnych do układów rzeczywistych (biologicznych). W pracy wykorzystano model – monooleina/woda, który utworzony w stosunku wagowym 64:36 tworzy w temperaturze 298 K ciekłokrystaliczną fazę kubiczną. Cele pracy: opracowanie sposobu przygotowania próbki fazy kubicznej do pomiarów NMR; sprawdzenie czy w badanym układzie dyfuzja jest nieograniczona; wyznaczenie współczynnika dyfuzji wybranych cząsteczek metodami NMR ( PGF-STE, DOSY). Przygotowanie próbki: Zamknięty lejek z 200 mg monooleiny i 120 µl wody wkłada się do plastikowej próbówki, którą umieszcza się na godzinę w wirówce (ok. 45 obr./s). Faza kubiczna tworzy się w stopce lejka o długości 4 cm. Tak powstałą próbkę termostatuje się w temperaturze 298 K przez 24 godziny. Następnego dnia jednorodną substancję umieszcza się w rurce szklanej o średnicy wewnętrznej 2,3 mm wypychając ją z lejka za pomocą metalowego tłoczka pokazanego na rysunku. Eksperyment: rejestracja widma 1D i 2D – analiza układu: Na rysunku pokazana jest zmiana intensywności widma NMR wraz ze zmianą gradientu pola G dla układu monooleina/woda. Zanik intensywności sygnału wody zaznaczono kolorem czerwonym. Szybkość dyfuzji wody jest więc znaczna w porównaniu do szybkości dyfuzji monooleiny. Na jednowymiarowym widmie 1H układu monooleina/woda widnieje 10 sygnałów w zakresie od 0,9 do 5,8 ppm. Wydłużając czas trwania gradientu zaobserwowano również zmiany intensywności widma monooleiny. Na rysunku sygnał odpowiadający cząsteczce wody (przy 4,7 ppm) zanika praktycznie natychmiastowo. Dzięki rejestracji widma dwuwymiarowego przyporządkowano monooleinie oraz wodzie odpowiadające im piki. Zalety metody dyfuzyjnej spektroskopii NMR: wykonuje pomiar nie zaburzając układ umożliwia badanie procesu dyfuzji zarówno w układach jedno-, jak i wieloskładnikowych; pozwala w łatwy sposób sprawdzić, czy w danym układzie dyfuzja jest ograniczona czy nieograniczona. Sygnał (singlet zaznaczony na rysunku przy 4,7 ppm) nieobecny jest na widmie 2D, co pozwala przyporządkować ten sygnał cząsteczce H2O. Uzyskane współczynniki dyfuzji w fazie kubicznej wynoszą: 6,6*10-10 m2/s dla wody i 0,4*10-10 m2/s dla monooleiny. Dla porównania współczynnik dyfuzji wody w wodzie wyznaczony tą samą techniką wynosi 19,6*10-10 m2/s. Właściwości fazy kubicznej, a pomiar NMR: badanie szybkości dyfuzji w układzie monooleina/woda: sprawdzenie zgodności układu z prawem Ficka: przeźroczystość - pozwala na badanie metodami spektroskopii optycznej; wysoka lepkość - stanowi utrudnienie przy przygotowaniu próbki NMR i zapewnieniu jednorodności pola magnetycznego Szybkość procesu dyfuzji cząstek określa parametr zwany współczynnikiem dyfuzji D. Pomiar metodą NMR opiera się na zależności współczynnika dyfuzji od intensywności sygnału widma NMR zgodnie z równaniem Stejskala-Tannera: Jeżeli w układzie cząsteczki poruszają się zgodnie z prawem Ficka i nie natrafiają na żadną barierę to mamy do czynienie z nieograniczoną dyfuzją. W takim przypadku współczynnik dyfuzji powinien być stały, niezależny od czasu. Współczynnik dyfuzji D wody [10-10 m2/s] W układzie monooleina/woda zależność ta zmiania się następująco, co może świadczyć o ograniczonej dyfuzji cząstek w tym układzie. - współczynnik żyromagnetyczny Konieczne stało się opracowanie metody wypełniania fazą kubiczną probówki o średnicy 2,3 mm z zachowaniem uporządkowania substancji w skali mikro. W tym celu skonstruowano układ pokazany na rysunku: G - amplituda liniowego gradientu pola - czas pomiędzy gradientami [s] - czas trwania danego gradientu [s] D - współczynnik samodyfuzji lejek szklany rurka szklana z korkami teflonowymi tłoczek metalowy z teflonowym zakończeniem Rejestrując zatem zmianę intensywności widma wraz ze zmianą gradientu pola G przy ustalonym czasie pomiędzy gradientami i czasie trwania tych zaburzeń pola magnetycznego wyznaczono współczynniki dyfuzji w badanych próbkach. Podsumowanie: Czas [ms] Dyfuzyjne techniki spektroskopii NMR wydają się doskonałymi narzędziami w badaniach układów biologicznych i biometrycznych. Dzięki zastosowaniu wspomnianej techniki możliwe stało się nie tylko badanie kształtu i rozmiaru molekuły, sposobu jej oddziaływań z innymi cząsteczkami, ale również wyznaczenie współczynników dyfuzji poszczególnych składników mieszaniny bez ingerencji w jej strukturę.