Enzymatyczne utlenianie alkoholi pierwszorzędowych WYNIKI:   REAKCJA KM [ mM ] Vmax [ min-1] KIE Enzymatyczne utlenianie CD3OD w buforze o pH 8,5 3,7* 10-1 2,5* 102 4,0 Enzymatyczne utlenianie CH3OD w buforze o pH 8,5 4,5* 10-1 9,3* 102 1,3 SIE Enzymatyczne utlenianie CH3OH w buforze o pH 8,5 5,0* 10-1 1,4 * 103 1,8 Enzymatyczne utlenianie CH3OH w buforze o pD 8,5 4,3* 10-1 6,7* 102 Enzymatyczne utlenianie propanolu w buforze o pH 8,5 4,76* 10-2 3,3* 102 PODSUMOWANIE: Zbadałam kinetykę reakcji enzymatycznego utleniania metanolu w roztworze wodnym i deuterowanym Zbadałam kinetykę reakcji enzymatycznego utleniania propanolu w roztworze wodnym Wyznaczyłam Vmax i KM zgodnie z charakterystyką Michaelisa – Menten i Lineweavera – Burka w roztworze wodnym dla reakcji enzymatycznego utleniania CH3OH, CD3OD, CH3OD i CH3CH2 CH2OH. Wyznaczyłam Vmax i KM zgodnie z charakterystyką Michaelisa – Menten i Lineweavera – Burka w buforze deuterowanym dla CH3OH. Wyznaczyłam kinetyczny i rozpuszczalnikowy efekt izotopowy dla reakcji enzymatycznego utleniania metanolu YADH jest tetramerem o wadze molekularnej 140 000-150 000 Da. Spośród dwóch jonów cynku obecnych w podjednostkach plipeptydowych tylko jeden jest aktywny katalitycznie – jon ten znajduje się w ”kieszeni” wiążącej substrat i wykorzystywany jest do przytrzymania i odpowiedniego ustawienia grupy hydroksylowej. Enzym dehydrogenaza alkoholowa z drożdży ( YADH ) katalizuje odwracalną reakcję utleniania alkoholi pierwszorzędowych do aldehydów zgodnie ze schematem: W wyniku redukcji pierścienia pirydynowego w amidzie kwasu nikotynowego (schemat 2), zachodzi zmiana w widmie absorpcyjnym dinukleotydu co umożliwia spektrofotometryczne śledzenie przebiegu reakcji. Poznanie mechanizmów reakcji chemicznych tj. dróg wiodących od substratu do końcowego produktu opiera się na studiowaniu ich kinetyki w różnych warunkach np. w zależności od stężenia, temperatury, pH, rodzaju rozpuszczalnika. Mimo wielu doniesień literaturowych mechanizmy reakcji utleniania alkoholi pierwszorzędowych nie są do końca poznane. Szczególnie wiele trudności nastręcza poznanie pośrednich etapów reakcji ponieważ tworzone w jej toku przejściowe produkty są zwykle nietrwałe i nieznana jest ich struktura. W zrozumieniu mechanizmów reakcji pomocne są metody kinetycznych efektów izotopowych - dostarczają informacji o miejscach , w których następuje zrywanie wiązań chemicznych i umożliwiają rozstrzygnięcie wielu wątpliwości związanych ze struktura kompleksu aktywnego NAD+ ( dinukleotyd nikotynoamidoadeninowy) pełni rolę akceptora wodoru. Pracownia Peptydów Żaneta Jackiewicz Kierownik i opiekun pracy: dr Jolanta Jaroszewska - Manaj 2.Wyznaczenie kinetycznego efektu izotopowego dla reakcji enzymatycznego utleniania CD3OD i CH3OD 3.Badanie kinetyki enzymatycznego utleniania propanolu LITERATURA: R.Murray Biochemia Harpera, 1998 C.J.Gray Enzyme – Catalysed Reactions, Van Nastrad Reinhold, Company, London Paul D. Boyer, Henry Lardy, Karl Myrback The Enzymes, Vol VII, 1963 Paul D. BoyerThe Enzymes, Vol IX, 1975 http://www.csb.ki.se/xray/gallery.html http://www.ebi.ac.uk/thornton-srv/databases/cgi-bin/pdbsum/GetPage.pl?pdbcode=2hcy CELE PRACY: 1. Zbadanie kinetyki reakcji utleniania wybranych alkoholi pierwszorzędowych: metanolu etanolu propanolu w roztworach wodnych i deuterowanych.  2. Zbadanie wpływu stężenia substratu , enzymu i pH na kinetykę reakcji utleniania alkoholi pierwszorzędowych. 3. Wyznaczenie parametrów kinetycznych Vmax ( szybkość maksymalna ), KM (stała Michaelisa ) zgodnie z charakterystyką Michaelisa- Menten i Lineweavera-Burka w roztworach wodnych i deuterowanych. 4. Wyznaczenie efektów izotopowych: SIE - rozpuszczalnikowego efektu izotopowego KIE - kinetycznego efektu izotopowego 1.Wyznaczenie rozpuszczalnikowego efektu izotopowego dla reakcji enzymatycznego utleniania metanolu. Schemat1. Schemat reakcji enzymatycznego utleniania alkoholi pierwszorzędowych Schemat2. Schemat redukcji pierścienia pirydynowego w NAD+ Ryc.1. Centrum aktywne YADH Ryc.2. Cząsteczka YADH Ryc.3. Struktura krystaliczna YADH