PRZEPROWADZONE BADANIA L-dopa jest to bardzo ważny naturalny aminokwas endogenny. Jest prekursorem w syntezie melanin, które są pigmentem występującym głównie w skórze właściwej i naskórku, a także w tęczówce, nadając jej zależnie od rozmieszczenia barwnika charakterystyczny kolor. L-dopa jest również prekursorem w syntezie amin katecholowych tj. dopaminy, noradrenaliny oraz adrenaliny. Znajduje ona także zastosowanie w farmakologii jako lek łagodzący skutki choroby Parkinsona. WŁAŚCIWOŚCI L-DOPY L - DOPA 3‘, 4'- dihydroksy-L-fenyloalanina Biały proszek słabo rozpuszczalny w wodzie, nierozpuszczalny w etanolu Temperatura topnienia 285ºC Stabilna przy pH 5,5-7,0 Do syntezy związków znakowanych wykorzystałam dwa enzymy: apotryptofanazę (EC 4.1.99.1) należącą do klasy liaz oraz tyrozynazę (EC 1.14.18.1) należącą do klasy oksyreduktaz. - Monooksygenaza monofenolowa lub polifenoloksydaza - Masa cząsteczkowa tyrozynazy wyizolowanej z Neurospora Crassa 46000 Daltonów - 407 aminokwasów Centrum aktywne zawiera diamagnetyczny kompleks miedzi (II) - Maksymalna aktywność: - T 20-30 ºC - pH 5,5 -7 - Rodzaje aktywności - krezolazowa hydroksyluje monofenole do o-difenoli - katecholazowa utlenia o–difenole do o-chinonów Inhibitory: - azydki, cyjanki, fenylomocznik, dietyloditiokarbamid, 2-merkaptoetanol, cysteina. Jest silnie hamowana przez substancje organiczne np. kwas benzoesowy i nieodwracalnie dezaktywowana w obecności substancji katecholowych. TYROZYNAZA EC 1.14.18.1 Celem mojej pracy magisterskiej było: Opracowanie metody syntezy, identyfikacji, wydzielenia i oczyszczenia L-tyrozyny i L-dopy znakowanych izotopami wodoru. Przeprowadzenie syntez: L-dopy [-2H]-L-dopy [-3H]-L-tyrozyny [-3H]-L-dopy [-2H/3H]-L-tyrozyny [-2H/3H]-L-dopy ENZYMATYCZNA SYNTEZA L-DOPY ZNAKOWANEJ IZOTOPAMI WODORU W POZYCJI α. Izabela Dąbrowska Praca magisterska wykonana w Pracowni Peptydów Wydziału Chemii Uniwersytetu Warszawskiego Promotor pracy: prof. dr hab. Marianna Kańska Opiekun pracy: mgr Małgorzata Pająk APOTRYPTOFANAZA EC 4.1.99.1 TYROZYNAZA EC 1.14.18.1 SYNTEZY [α-X]-L-DOPY PRZEPROWADZONE BADANIA Przed przystąpieniem do syntez radioaktywnych przeprowadziłam serię eksperymentów ze związkami nieaktywnymi w celu ustalenia optymalnych warunków rozdziału, identyfikacji oraz oczyszczenia [-X]-L-tyrozyny i [-X]-L-dopy. [-2H/3H]-L-TYROZYNA gdzie X = 2H, 3H, 2H/3H SYNTEZY [-X]-L-TYROZYNY [-3H]-L-TYROZYNA Miejsce i stopień inkorporacji deuteru do cząsteczki [-X]-L-tyrozyny potwierdzano przy pomocy widm protonowego rezonansu jądrowego. gdzie X= H, 2H, 3H, 2H/3H LITERATURA R. Murray Biochemia Harpera 1998 HS. Pomerantz Biochemical and Biophysical Research Communications 1964, 16, 188-194. HS. Pomerantz The Journal or Biological chemistry 1963, 238, 2351-2357. VJ. Hearing, TM. Ekel The Biochemical Journal 1976, 157 549-57. JR Ros, JN. Rodriguez-Lopez, F. Garcia-Canovas The Biochemical journal 1993, 295, 309-12. J. Haavik Journal Neurochemistry 1997, 69, 1720-8. K. Lerch The Proceedings of the National Academy of Sciencess of the USA 1978, 75, 3635-9. C. Chintamaneni, A.R.Nadimpali Indian journal of biochemistry and biophysics 1991, 28, 408 – 411 C.Daglish The Biochemical journal 1951, 49, 639-642. PODSUMOWANIE Cele jakie postawiłam sobie na początku realizowania mojej pracy zostały przeze mnie osiągnięte. Otrzymałam następujące związki: [-2H]-L-dopę, [-3H]-L-tyrozynę, [-3H]-L-dopę, [-2H/3H]-L-tyrozynę, [-2H/3H]-L-dopę. Związki otrzymane przeze mnie zostaną wykorzystane do badania mechanizmu reakcji tworzenia dopaminy metodą kinetycznych efektów izotopowych. Obecność [α-X]-L-dopy mogłam potwierdzić za pomocą chromatografii cienkowarstwowej wykorzystując płytki pokryte tlenkiem glinu. Płytki rozwijałam w układzie C4H9OH : CH3COOH : H2O (4:1:2) (v/v), a wywoływałam alkoholowym roztworem ninhydryny. Dodatkowo obecność [α-X]-L-dopy sprawdzałam dodając KIO3. Reakcja zachodzi w temperaturze pokojowej. W wyniku tej reakcji powstaje 1,2-dopachinon. W trakcie tworzenia się chinonu następowała zmiana zabarwienia roztworu z bezbarwnego na pomarańczowy. Do rozdziału [-X]-L-tyrozyny i [-X]-L-dopy wybrałam chromatografię kolumnową. Wypełnieniem był tlenek glinu zawieszony w octanie amonu. Tyrozynę wymywałam octanem amonu, a [-X]-L-dopę kwasem solnym. Oczyszczanie [-X]-L-dopy przeprowadziłam na kolumnie wypełnionej tlenkiem glinu zawieszonym w wodzie. [-X]-L-dopę wymywałam kwasem solnym. W przypadku syntez [-X]-L-dopy znakowanej trytem oraz deuterem i trytem jednocześnie przeprowadziłam badania radiochemiczne. Poniżej przedstawione są radiochromatogramy. [-2H/3H]-L-DOPA [-2H/3H]-L-TYROZYNA [-3H]-L-TYROZYNA [-3H]-L-DOPA Do identyfikacji [-X]-L-tyrozyny wykorzystałam chromatografię cienkowarstwową. W tym celu użyłam płytek pokrytych żelem krzemionkowym, które rozwijałam w układzie CH3CN : H2O (4:1) (v/v). Wizualizacji dokonywałam przy pomocy roztworu ninhydryny. Oczyszczanie [-X]-L-tyrozyny przeprowadziłam na kolumnie wypełnionej Amberlitem IR 120 H+ zawieszonym w wodzie i aktywowanym kwasem solnym. Tyrozynę wymywałam amoniakiem. W przypadku syntez radioaktywnych przeprowadziłam badania radiochemiczne. Poniżej przedstawione są radiochromatogramy.