Formalina ... Idealny utrwalacz? Matthew Ibbs Wielkopolskie Centrum Onkologii Zakład Patologii Nowotworów

Formalina ... Idealny utrwalacz? 1. Krótka (bardzo) historia formaliny w histopatologii 2. Cechy dobrego utrwalacza 3. Czy formalina jest dobra? Jak działa? 4. Problemy

Krótka (bardzo) historia formaliny 1859 Formaldehyd odkryty przez Butlera 1868 Hoffman opracował metody jego syntezy z metanolu Odkrycia, że formalina może być użyta jako utrwalacz, dokonane zostało przypadkiem, gdy pewna niemiecka firma zleciła chemikowi przemysłowemu, Ferdynandowi Blumowi, sprawdzenie, czy formalina może być używana do odkażania. Blum zauważył, że po dłuższym kontakcie z formaliną opuszki jego palców twardnieją, co zapoczątkowało serię doświadczeń badających przydatność formaldehydu jako czynnika utrwalającego tkanki. Odkrycie Bluma opublikowano w roku 1893 po jego potwierdzeniu przez Carla Weigerta. Reszta, to historia

Cechy dobrego utrwalacza 1. Szybka penetracja tkanki 2. Szybkie reagowanie 3. Jak najmniejsze zmiany strukturalne 4. Bezpieczne w użytkowaniu 5. Niskie koszty

Penetracja Według Medawara prędkość penetracji dla jakiegokolwiek utrwalacza może być obliczana według następującego wzoru: d = k √ t d = depth (głębokość penetracji)‏ k = współczynnik penetracji t = time (czas w godzinach)‏ Według Medawara „K” dla formaldehydu to 5.5 a więc penetruje 27 mm w ciągu 25 godz. Medawar eksperymentował na surowicy, która różniła się od prawdziwych tkanek. Rzeczywista wartość „k” jest więc mniejsza.

Penetracja Baker powtórzył doświadczenia Medawara ale korzystał z żelu z albuminy i żelatyny. Jego eksperymenty sugerują, że wartość „k” dla formaldehydu to około 3,6 a więc penetruje około 18 mm w ciągu 25 godz. Ale żel to nie tkanka...

Penetracja Wcześniej, Tellyesnicsky wprowadził podobne doświadczenia na wątrobie. Z jego wyników można twierdzić że wartość „k” dla formaldehy to tylko 0,78 a więc, penetracja tylko 3,6 mm w ciągu 25 godz.

Penetracja Kto ma rację?

Nikt nie ma racji ponieważ.... Penetracja Nikt nie ma racji ponieważ.... Pierwsze warstwy komórek penetrowane są bardzo szybko (wystarczy kilka sekund). Dalsza penetracja jednak postępuje coraz wolniej z uwagi na to, że formaldehyd powoduje utwardzenie zewnętrznej warstwy i w konsekwencji zwalnia penetrację głębszych warstw.

Reagowanie Penetracja to tylko część problemu. Bardziej istotny jest czas reakcji między formaldehydem a tkanką. Ta faza to właściwe utrwalenie i sama penetracja utrwalacza nie jest wystarczająca. Kluczowym elementem jest stabilizacja, która jest związana z reagowaniem, a nie z penetracją.

Reagowanie Formaldehyd z C14 1985 – Fox – 25°C, 16 mm plastry nerki (szczur)‏ 1994 – Helander – 25°C, 4 mm kawałki wątroby (królik)‏ Według Fox, stabilzacja następuje po 24 godz. Według Helander, stabilzacja następuje po 25 godz. Niezależnie od grubości, stabilizacja trwa co najmniej 24 godz i może trwać aż do 48 godz.

Proces utrwalenia trwa dalej, nawet do 5 – 7 dni. Reagowanie Proces utrwalenia trwa dalej, nawet do 5 – 7 dni. Zbyt długie utrwalenie ma wpływ na badania immunohistochemiczne z uwagi na zablokowanie antygenów ale większość przeciwciał dostępnych na rynku będzie działać w większość pracowni jeżeli IMH jest dobrze optymizowany. Czas reagowania jest niezależny od czasu penetracji – ten fakt powoduje duże problemy. Często, reagowanie kończy się kiedy procesor tkankowy zaczyna działać, a to nie zawsze jest odpowiednie dla wszystkich materiałow znajdujących się w procesorze.

Reagowanie Źródło: Thermo-Shandon www.thermo.com Tutaj widać jak podobne są formaldehyd i metanol. Formalina (koncentrat około 40%) zawiera około 15% metanolu. Formaldehyd reaguje z terminalami „N” sąsiednich protein budując „mostki metylowe” (C-H-C) a także reaguje z grupami tiolowymi (-SH) z aminokwasu cysteina, budując wiązania krzyżowe. Proces ten cofa się w wodzie więc nie należy zbyt intensywnie płukać wycinków przed ładowaniem do procesora tkankowego.

Formaldehyd jest, pod tym względem, dobry. Reagowanie Utrwalacz ma wprowadzić do materiału jak najmniejsze zmiany strukturalne. Utrwalacze alkoholowe powodują kurczenie się materiału aż o 30%. Aldehydy taki jak formaldehyd też powodują efekt kurczenia ale w znacznie mniejszym stopniu. Formaldehyd jest, pod tym względem, dobry.

Nie ma bezpiecznego utrwalacza. Bezpiecznie Utrwalacze są niebezpieczne z natury. Celem utrwalacza jest wprowadzenie całkowitej stabilności do materiału, tak że proteiny nie będą degradowane i tak że mikroorganizmów nie będą mieć wypływ na stan materiału. Nie ma bezpiecznego utrwalacza. Jednak, formalina jest stosunkowo łagodna w porównaniu z innymi aldehydami (np. aldehyd glutarowy).

Koszt Utrwalacze są używane w ogromnych ilościach – i tak ma być. Utrwalacz powinien być zmieniany często, aby reaktywność składników była ciągle optymalna. Dlatego utrwalacz musi być tani. Formalina jest tania. Formalina jest używana nie tylko jako utrwalacz ale również jest używana w procesach przemysłowych (produkcji mebli, chemikalia domowe, kosmetyki itd.)‏

Podsumowanie Formalina nie jest idealnym utrwalaczem – nie ma takich. Proces utrwalania jest znacznie wolniejszy niż się powszechnie uważa i jest co najmniej częściowo wycofywalny w wodzie. Jednak, formalina jest tania, nieznacznie zmienia kształt i rozmiar materiału. Jako uniwersalny utrwalacz, jak na razie, chyba nie ma lepszej alternatywy.

Dziękuję za uwagę.