Określanie mechanizmów reakcji enzymatycznych Enzymologia-6 Określanie mechanizmów reakcji enzymatycznych Przykłady
Lizozym Reakcja katalizowana przez enzym Schemat struktury peptydoglikanu Reakcja katalizowana przez enzym Hydroliza wiązania glikozydowego między atomem węgla C-1 reszt kwasu N-acetylomuraminowego i atomęm C-4 N-acetyloglukozaminy
Model przestrzenny cząsteczki lizozymu
Wiązania wodorowe pomiędzy (NAG)3 i lizozymem
Sposób wiązania (NAG)6 z lizozymem Kolor żółty - (NAG)6 ; kolor niebieski – reszty aminokwasowe enzymu; Kolor czerwony – reszty aminokwasowe enzymu biorące bezpośredni udział w katalizie
Struktura części centrum aktywnego lizozymu. Kolorem żółtym oznaczono atomy pierścieni D i E substratu (NAG)6
Badanie specyficzności substratowej lizozymu Porównanie szybkości hydrolizy oligomerów NAG NAG2 0 NAG5 4 000 NAG3 1 NAG6 30 000 NAG4 8 NAG8 30 000 Produkty hydrolizy: NAG6 NAG4 + NAG2
Analog substratu, laktonowa pochodna (NAG)4, wiąże się z enzymem 3 600 razy silniej niż (NAG)4. Wniosek: związek jest analogiem stanu przejściowego
Obraz struktury kompleksu enzym:NAM-NAG-NAM. Ligand zajmuje miejsce B-C-D, a nie A-B-C, bo NAM jest zbyt duży aby zająć miejsce C. NAM w miejscu D przyjmuje konformację półkrzesłową
Określenie miejsca hydrolizy substratu Które wiązanie ulega hydrolizie? Informacje wyjściowe: w peptydoglikanie hydrolizowane jest wiązanie NAM-NAG (NAG)3 nie ulega hydrolizie; NAM nie może zajmować miejsca C (zawada przestrzenna)
Ustalenie roli reszt katalitycznych Profil zależności szybkości reakcji od pH Klasyczna krzywa dzwonowa. Maksimum około pH = 5.0 Spadek aktywności po stronie alkalicznej – wynik jonizacji Glu-35 Spadek aktywności po stronie kwasowej – wynik protonowania Asp52 Modyfikacja chemiczna Estryfikacja Asp52 – całkowita utrata aktywności; związanie substratu chroni enzym przed inaktywacją
Mechanizm reakcji katalizowanej przez lizozym Etap I – protonowanie atomu tlenu wiązania glikozydowego przez Glu 35 Etap II – przyłączenie anionu OH- z wody do jonu karboniowego i H+ do grupy COO- reszty Glu 35
Chymotrypsyna Enzym proteolityczny, wytwarzany przez trzustkę w formie proenzymu (chymotrypsynogen). Chymotrypsyna należy do grupy proteaz serynowych Specyficzność substratowa ustalona na podstawie peptydów modelowych Reszta seryny 195 jest szczególnie reaktywna. Selektywna modyfikacja przez DIPF oraz PMSF
Modyfikacja chemiczna Ukierunkowana mutageneza Mutant Asp102Asn wykazuje kkat 5000 razy niższe niż enzym typu dzikiego TPCK – specyficzny inaktywator chymotrypsyny Ser195, His57 i Asp102 tworzą triadę katalityczną TPCK alkiluje resztę His 57
Struktura przestrzenna chymotrypsyny
Wiązanie substratu Hydrofobowa kieszeń chymotrypsyny; miejsce rozpoznania i wiązania substratu Porównanie miejsc wiązania substratu w niektórych proteazach serynowych
Określenie mechanizmu katalizy Detekcja intermediatów - acyloenzym Acyloenzym powstający w wyniku działania octanu p-nitrofenylu na chymotrypsynę można wyizolować, jeżeli reakcję prowadzi się w niskim pH
Określenie mechanizmu katalizy Detekcja intermediatów – tetraedryczny stan przejściowy 1. Niskotemperaturowy 13C NMR Przejściowy produkt reakcji można wykryć poprzez identyfikację sygnału pochodzącego od znakowanego atomu węgla 2. Inhibitory – analogi stanu przejściowego
Mechanizm reakcji katalizowanej przez chymotrypsynę
Stabilizacja stanu przejściowego w centrum aktywnym