Zastosowanie metody PCR do identyfikacji rodzajowej szczepów Fusarium izolowanych z pszenicy A. Misiewicz, M. Spera, M. Suchorzyńska Instytut Biotechnologii Przemysłu Rolno-Spożywczego ul. Rakowiecka 36, 02-532 Warszawa Wstęp Grzyby z rodzaju Fusarium są najczęściej występującymi patogenami grzybowymi na świecie. Wśród tej grupy mikroorganizmów, do najbardziej powszechnych i niebezpiecznych należą: F. culmorum, F. graminearum, F. nivale, F. avenaceum, F. sporotrichioides, F. poae, F. oxysporum. Grzyby z rodzaju Fusarium zostały uznane za najgroźniejsze spośród innych rodzajów grzybów pleśniowych ponieważ są przyczyną chorób roślin, ludzi i zwierząt. Mogą powodować grzybice skóry, rogówki oka, obniżają odporność w terapiach klinicznych. Infekują rośliny, które mają podstawowe znaczenie dla człowieka, jak zboża drobnoziarniste (pszenica, żyto, jęczmień, owies i pszenżyto), ziemniaki, kukurydzę. Dodatkowo grzyby te są zdolne do syntezy wysoce niebezpiecznych i toksycznych związków zwanych mikotoksynami. Mikotoksyny to wtórne metabolity, wpływają one na ludzi i zwierzęta prowadząc do zaburzeń m. in. układu pokarmowego, odpornościowego. Spożywanie zakażonej żywności może powodować biegunki, krwotoki, zaniki łaknienia, uszkodzenia nerek, nowotwory (przełyku, wątroby), doprowadzając do śmierci. Negatywny wpływ na rośliny przejawia się przez hamowanie wzrostu czy kiełkowanie nasion. W celu uniknięcia strat upraw powodowanych przez Fusarium sp. oraz szybkiego wykrycia przyczyn infekcji u ludzi i zwierząt wykorzystuje się metody biologii molekularnej Specyficzne startery są konstruowane na podstawie stabilnych sekwencji obejmujących geny rybosomalne RNA: 18S, 5,8S oraz 28S, które występują w formie jednostek transkrypcyjnych, jako wielokrotne powtórzenia w genomie. Zawierają one miejsca wysoce konserwatywne dzięki czemu można wykorzystać je do wykrywania i identyfikacji mikroorganizmów. Geny rDNA są powszechnie stosowane do identyfikacji grzybów, w badaniach taksonomicznych czy do określania przynależności szczepów do rodzaju Fusarium. Cel pracy Celem pracy było sprawdzenie przy pomocy metod biologii molekularnej przynależności rodzajowej izolatów grzybów strzępkowych zidentyfikowanych wcześniej za pomocą kluczy mikologicznych oraz ocena skuteczności zastosowanych starterów. Materiały i metody Materiałem badawczym wykorzystanym do analiz były izolaty grzybów pozyskane z ziarna pszenicy. Do analiz przeznaczono 106 szczepów oznaczonych według kluczy mikologicznych, w tym 84 izolaty zakwalifikowane jako należące do rodzaju Fusarium. Szczepy kontrolne z rodzaju Fusarium, Trichoderma i Aspergillus pochodziły z Kolekcji Kultur Drobnoustrojów Przemysłowych. W testach wykorzystano 2 pary starterów P28SL, P58SL oraz ITS1 i ITS4. => => => => => 1. Zbiór z pola 2. Wybór porażonego ziarna 3. Rozwój grzybów na wyizolowanych ziarnach 4. Wzrost izolatów na podłożu selektywnym DRBC 5. Ocena mikroskopowa izolatów do rodzaju Fusarium 6. Analizy molekularne z badanymi izolatami Etapy uzyskania materiału badawczego do analiz molekularnych Wyniki W celu potwierdzenia przynależności badanych szczepów do rodzaju Fusarium wykonano analizy PCR z wykorzystaniem dwóch różnych par starterów. W analizie PCR ze starterami P58SL, P28SL uzyskano produkty amplifikacji o wielkości 329 pz dla wszystkich badanych szczepów z rodzaju Fusarium, dodatkowo uzyskano produkty dla szczepów kontrolnych wybranych Fusarium, 2 z 3 szczepów Trichoderma i brak dla szczepu z rodzaju Aspergillus. Aby sprawdzić i potwierdzić uzyskany wynik, przeprowadzono analizę PCR z uniwersalnymi primerami grzybowymi ITS1, ITS4. Otrzymano produkty o rozmiarach charakterystycznych dla rodzaju: Fusarium (550-570 pz) w stosunku do badanych szczepów i zastosowanych kontroli Fusarium, produkty 560-600 pz dla wszystkich szczepów z rodzaju Trichoderma i 570-590 pz dla Aspergillus. ←329pz Rys.1. Weryfikacja przynależności szczepów do rodzaju Fusarium ze starterami P58SL i P28SL. Studzienki 1-12 badane izolaty Fusarium; studzienka 13- F. verticillioides Rys.3. Weryfikacja przynależności szczepów do rodzaju Fusarium ze starterami ITS1 iITS4. Studzienki 1-12 badane izolaty Fusarium; 13- F. verticillioides 1000pz → 500pz → M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 250pz → Rys.2. Weryfikacja przynależności szczepów do rodzaju Fusarium ze starterami P58SL i P28SL. Studzienki 1-Fusarium sp., 2-F. oxysporum, 3-F. avenaceum; 4-A.awamori; 5-T.harzianum; 6-Trichoderma sp.; 7-T. viride; 8-kontrola negatywna Rys.4. Weryfikacja przynależności szczepów do różnych rodzajów grzybów ze starterami ITS1, ITS4. Studzienki 1-Fusarium sp., 2-F. oxysporum, 3-F. avenaceum; 4- A.awamori; 5- T. harzianum; 6- Trichoderma sp.; 7-T. viride; 8-kontrola negatywna 500pz → M 1 2 3 4 5 6 7 8 M 1 2 3 4 5 6 7 8 ←329pz 250pz → 1000pz → Wnioski Spośród 106 izolatów, 100 zidentyfikowano jako należące do rodzaju Fusarium. Metoda z wykorzystaniem reakcji PCR jest skutecznym narzędziem do określania przynależności rodzajowej patogenów grzybowych z rodzaju Fusarium z wykorzystaniem starterów P28SL i P58SL oraz ITS1 i ITS4.