Pobieranie prezentacji. Proszę czekać

Pobieranie prezentacji. Proszę czekać

Aktualne metody typowania tkankowego, zgodność pary dawca biorca Jacek Nowak Zakład Immunogenetyki, Instytut Hematologii i Transfuzjologii, Warszawa Konferencja.

Podobne prezentacje


Prezentacja na temat: "Aktualne metody typowania tkankowego, zgodność pary dawca biorca Jacek Nowak Zakład Immunogenetyki, Instytut Hematologii i Transfuzjologii, Warszawa Konferencja."— Zapis prezentacji:

1 Aktualne metody typowania tkankowego, zgodność pary dawca biorca Jacek Nowak Zakład Immunogenetyki, Instytut Hematologii i Transfuzjologii, Warszawa Konferencja POLTRANSPLANT: Szkolenie osób, których czynności bezpośrednio wpływają na jakość komórek krwiotwórczych, a także na bezpieczeństwo dawców i biorców. Warszawa, Hotel Sobieski, 8-9 grudnia 2011 r.

2 Metody genotypowania HLA PCR-SSP PCR-SSOP PCR-SSOP Luminex PCR-SSOP Luminex HD PCR-RSCA PCR-SBT (met. Sangera) PCR-SBT (pyrosekwencjonowanie) Rozdzielczość Niska Pośrednia Wysoka Testy HLA

3 Porównanie metod SSP i SSOP SSOP l Izolacja DNA l Amplifikacja DNA –nieswoista –jedna para primerów –długi fragment (primery flankują cały exon) l Hybrydyzacja swoista (wiele swoistych sond na pasku nitrocelulozy) l Barwienie produktów hybrydyzacji, odczyt l Analiza komputerowa konstelacji dodatnich sond l Interpretacja immunogenetyczna SSP l Izolacja DNA l Amplifikacja DNA –swoista –wiele par primerów –krótkie fragmenty (primery flankują krótkie miejsca polimorficzne exonu) l Elektroforeza wielu produktów PCR l Odczyt l Analiza komputerowa konstelacji dodatnich PCR l Interpretacja immunogenetyczna

4 1. Przygotowanie mieszaniny reakcyjnej PCR - DNA - Taq polimeraza - dNTPy - Bufor, Mg Przeniesienie do wielu probówek reakcyjnych o różnej swoistości - swoiste primery PCR SSP

5 3. Reakcja PCR - wiele amplifikacji swoistych - denaturacja - renaturacja (hybrydyzacja) - elongacja 3. Przeniesienie na żel agarozowy (ważne pozycjonowanie dołków). PCR SSP

6 5. elektroforeza6. transiluminator PCR SSP

7 7. Zdjęcie i analiza wzoru prążków (archiwizacja) PCR SSP

8 7. Analiza wzoru prążków PCR SSP

9 PCR SSO

10 PCR SSO - wzór prążków

11 Analiza konformacji referencyjnej nici DNA RSCA, (Reference strand conformation analysis) Analiza konformacji referencyjnej nici DNA

12 SBT (met. Sangera) l Izolacja DNA l Amplifikacja 1 (swoista dla exonu) –Klasa I – exony 2 i 3 –Klasa II – exon 2 –Dodatkowe exony (4,5,6,7) l Oczyszczanie l Amplifikacja 2 (nested PCR) wraz terminacją znakowanymi nukleotydami kończącymi l Elektroforeza kapilarna l Detekcja laserowa i określenie sekwencji nukleotydów l Analiza porównawcza bibliotek sekwencji alleli HLA

13 Sekwencjonowanie SBT, ( Sequence-based typing) Sekwencjonowanie

14

15 Pyrosekwencjonowanie polega na syntezie kolejnych nukleotydów i detekcji wydzielanego PPi

16 Stopniowe rozszerzanie typowania HLA A, B, DRB1 1. Wstępne typowanie chorego A, B, DRB1 l.r. (dobór rodzinny, skierowanie na poszukiwanie dawcy niespokrewnionego j.w. 2. Wstępne typowanie dawców do rejestru (j.w.) A, C, DRB1(ew. DQB1) 3. Typowanie potwierdzające w doborze rodzinnym - A, C, DRB1(ew. DQB1) l.r. Wybrane locus 4. Typowanie uzupełniające dawców - Wybrane locus l.r./H.R., kilku dawców jednocześnie C i DQB1A, B, C, DRB1 i DQB1 5. Typowanie potwierdzające w doborze dawcy niespokrewnionego - C i DQB1 l.r. oraz A, B, C, DRB1 i DQB1 H.R.

17 Czynniki wpływające na wynik przeszczepu l HLA l rozpoznanie l faza choroby l dawka komórek CD34+ l status CMV i inne herpeswirusy l płeć l wiek chorego/dawcy l grupa krwi AB0 l wiek dawcy l mHA l polimorfizm KIR i cytokin Kumulatywny wpływ na wynik przeszczepienia }

18 liczby niezgodnych alleli lub antygenów Prawdopodobieństwo przeżycia chorych w zależności od liczby niezgodnych alleli lub antygenów HLA-A, B, C, DRB1 i DQB1 wyznaczane metodą Kaplana- Meiera. Według 13-th International Histocompatibility Working Group in Hematopoietic Cell Transplantation.

19 w zależności od niezgodnego locus Tabela 4.4. Śmiertelność całkowita pacjentów po transplantacji krwiotwórczych komórek macierzystych. Proporcja ryzyka (hazard ratio) w regresyjnym modelu wielu zmiennych w zależności od niezgodnego locus. Analizę ograniczono do par z pojedynczą niezgodnością. Według 13-th International Histocompatibility Working Group in Hematopoietic Cell Transplantation. [C*-B*-DRB1*] jest centralną częścią haplotypu HLA

20 Niezgodność allelu lub antygenu klasy I vs. zgodność (Przewlekła choroba GvH) Greinix HT et al. (2005) Bone Marrow Transplantation 35, 57–62...ale w analizie wieloczynnikowej (multivariate analysis), niezgodność allelu HLA klasy I nie miała istotnego wpływu na OS (P=0.18).

21 Źródła przeszczepu komórek krwiotwórczych l Dawca klasyczny –rodzeństwo l Dawcy alternatywni –dawcy niespokrewnieni zgodni ( ) –krew pępowinowa prawie zawsze niezgodna ( ) –niespokrewnieni częściowo niezgodni –pozostali członkowie rodziny i haploidentyczni Preferujemy poszukiwanie najlepszego możliwego dawcy we wszystkich dostępnych źródłach.

22 Kryteria doboru dawcy rodzinnego spośród rodzeństwa l Pełna zgodność w 4 (5) loci na poziomie niskiej rozdzielczości A, B, Cw, DRB1, (DQB1) Rzadko możliwa jest optymalizacja doboru dawcy rodzinnego (płeć, CMV, grupa krwi) - jeśli jest więcej niż 1 potencjalny dawca

23 Dawca rodzinny spośród rodzeństwa Cel typowania HLA: 1. Wykazanie, że dawca odziedziczył te same haplotypy HLA co chory 2. Wykluczenie zjawiska crossing over

24 A*0301 Cw*0702 B*0702 DRB1*1501 DQB1*0602 A*2501 Cw*1203 B*1801 DRB1*1301 DQB1*0603 A*0101 Cw*0701 B*0801 DRB1*0301 DQB1*0201 A*2402 Cw*0702 B*0702 DRB1*1501 DQB1*0602 A*0101 Cw*0701 B*0801 DRB1*0301 DQB1*0201 A*2501 Cw*1203 B*1801 DRB1*1301 DQB1*0603 ojciec matka pacjent Dziedziczą się całe haplotypy HLA, tworząc genotypy a b c d a d rodzeństwo a/d a/c a/d b/c b/d

25 DRB1*1501 DQB1*0602 A*0301 Cw*0702 B*0702 DRB1*1501 DQB1*0602 A*2501 Cw*1203 B*1801 A*2501 Cw*1203 B*1801 DRB1*1301 DQB1*0603 A*0101 Cw*0701 B*0801 DRB1*0301 DQB1*0201 A*2402 Cw*0702 B*0702 DRB1*1501 DQB1*0602 A*0101 Cw*0701 B*0801 DRB1*0301 DQB1*0201 A*2501 Cw*1203 B*1801DRB1*1501 DQB1*0602 A*2501 Cw*1203 B*1801 DRB1*1501 DQB1*0602 ojciec matka pacjent Rekombinacja w obszarze MHC (1%) = nowy haplotyp/genotyp a b c d a d+c

26 Obliczanie szansy znalezienia przynajmniej jednego zgodnego dawcy w zależności od liczby rodzeństwa 0.25 = prawdopodobieństwo przy 1 osobie, n = liczba osób P = 1 - (1 – 0.25) n

27 Wynik rodzinnego typowania HLA musi być zgodny z zasadami dziedziczenia. 1.Allele wszystkich loci pochodzą od biologicznych rodziców, po jednym od każdego z nich; 2.Tylko 4 haplotypy w rodzinie; 3.Możliwa jest rekombinacja (crossing over), ale rzadko; 4.Nie można dziedziczyć dwóch haplotypów od jednego rodzica, ale rodzic może być zgodny z dzieckiem (rzadko) 5.Podwójna rekombinacja praktycznie nie występuje, itp…

28 Szansa na pełną zgodność HLA pomiędzy rodzicem a dzieckiem (np. jeśli oboje rodzice dziedziczą taki sam haplotyp) 1-3% Optymalizacja - 1 haplotyp wspólny

29 Wstępne badanie HLA w najbliższej rodzinie chorego Zakres: A,B,DRB1; n.r.

30 Potwierdzające badanie HLA chorego i zgodnego członka rodziny (1 lub więcej) Zakres: A,B,C,DRB1,(DQB1); n.r. Nowe próbki Wstępne badanie HLA w najbliższej rodzinie chorego Zakres: A,B,DRB1; n.r.

31 Brak dawcy rodzinnego

32 Copyright© American Society of Clinical Oncology Yakoub-Agha, I. et al. J Clin Oncol 2006; 24: (D) GVHD stopnia II do IV Częstości skumulowane (A) całkowitego przeżycia, (B) przeżycia wolnego od choroby, (C) śmiertelności związanej z przeszczepieniem, (D) GVHD stopnia II do IV, (E) wznowy, i (F) GVHD stopnia III do IV u 236 pacjentów, zależnie od typu dawcy Dawcy niespokrewnieni a rodzinni

33 Kryteria doboru dawcy niespokrewnionego l Pełna zgodność w 5 loci A, B, Cw, DRB1, DQB1 na poziomie alleli Optymalizacja 1. Poprawa rozdzielczości typowania HLA 2. Poprawa przygotowania i leczenia powikłań potransplantacyjnych u pacjenta

34 1. dawca z Niemiec Etap CT: DKM zgłosił astmę oskrzelową.

35 2. dawca z Kanady: Etap CT: CAUB Niezgodność 1 allelu w locus B; Fenotypowo zgodny w 10/10 alleli

36 2. dawca z Kanady: Etap CT: CAUB Niezgodność 1 allelu w locus B; Fenotypowo zgodny w 10/10 alleli

37 2. dawca z Kanady: Etap CT: CAUB Niezgodność 1 allelu w locus B; Fenotypowo zgodny w 10/10 alleli

38 Błędne typowanie pacjenta Pacjent B.J. Wykryto błędne typowanie w locus A. Dobrano zgodnego dawcę krajowego.

39

40

41

42

43 Błędne typowanie pacjenta prowadzi do: l fałszywej oceny szansy na znalezienie dawcy, l błędny kierunek poszukiwań, l opóźnienie.

44 Błędne typowanie pacjenta Pacjent S.T. Wykryto błąd typowania w dwóch loci (A, DRB1). Dobrano dwóch rodzinnych dawców.

45

46 Haplotypy pacjentki: a - A*02-B*49-Cw*07-DRB1*0401-DQB1*0302 b - A*25-B*18-Cw*12-DRB1*1501-DQB1*0602 a,c a,f b,d b,h f,ba,bf,ha,b Pacjentka V.B. Zgodny kuzyn P.B. b,g d,h a,e c,f Rodzice pacjentki Rodzeństwo rodziców pacjentki f,h Pokrewieństwo małżeństw Dziedziczenie dwóch identycznych haplotypów przez obustronnego kuzyna i pacjentkę V.B. Badanie HLA u wszystkich obustronnych kuzynów chorej

47 Dobór NDSz w zakresie ligandów KIR

48 Struktura cząsteczki HLA klasy I Histocheck, in: Elsner et al. Bone Marrow Transplantation (2004) 33, 165–169 β2-mikroglobulina Rowek, β-pofałdowana kartka α1 α-helix, ARS - Antigen Recognition Site Prezentowany peptyd α2 α3

49

50 Typ KIR jest wiązany przez supertypową grupę antygenów HLA 1. Mary Carrington, et al. The KIR Gene Cluster. 2003:National Library of Medicine NCBI, Bethesda MD, USA. Niezgodność TCR-MHC Brak niezgodności KIR

51 1. Mary Carrington, et al. The KIR Gene Cluster. 2003:National Library of Medicine NCBI, Bethesda MD, USA. Niezgodność TCR-MHC oraz niezgodność KIR Typ KIR jest wiązany przez supertypową grupę antygenów HLA

52 Potencjalne znaczenie ligandów KIR w HSCT Niezgodność ligandów KIR w kierunku GvH –Korzystny efekt GvL 1) szczególnie w białaczce szpikowej 3) z tylko nieznacznym efektem GvH 1) –immunoablacja 2) 1) Ruggieri L, et al. 1999, Blood 94, ) Ruggieri L, et al. 2000, Blood 96, 473a 3) Giebel S, et al. 2003, Blood 102, 814-9

53 Korzystny wpływ niezgodności ligandów KIR (OS i DFS) Kierunek GvH, pacjenci CML, leczenie ATG Giebel S, Locatelli FW, Lamparelli T, et al. Survival advantage with KIR ligand incompatibility in hematopoietic stem cell transplantation from unrelated donors. Blood. 2003;102:

54 1. Jakie są dozwolone KIR u dawcy? 2. Czy HLA biorcy je zahamują? Ad 1: KIR dawcy (kierunek GvH) - KIR2DL2/3 Ad 2: Czy biorca je zahamuje? - TAK Nie ma niezgodności KIR Wniosek: Nie ma niezgodności KIR Selekcja dawców w zakresie ligandów KIR

55 1. Jakie są dozwolone KIR u dawcy? 2. Czy HLA biorcy je zahamują? 2DL2/3 Ad 1: KIR dawcy (kierunek GvH) - KIR2DL1; 2DL2/3 Ad 2: Czy biorca je zahamuje? - NIE Wystąpiła niezgodność KIR Wniosek: Wystąpiła niezgodność KIR Selekcja dawców w zakresie ligandów KIR

56 KIR Ligand Calculator (Zgodni) Robinson J, Mistry K, McWilliam H, Lopez R, Marsh SGE. IPD - the Immuno Polymorphism Database Nucleic Acids Research (2010), 38: D863-9

57 Robinson J, Mistry K, McWilliam H, Lopez R, Marsh SGE. IPD - the Immuno Polymorphism Database Nucleic Acids Research (2010), 38: D863-9 KIR Ligand Calculator (Niezgodność GvH = GvL) Chory:B.Ł. dgn. AML

58 Copyright ©2004 American Society of Hematology. Bornhauser, M. et al. Blood 2004;103: OS, DFS, wznowa związana z przeszczepieniem

59 Dobór dawcy KK niezgodnego w zakresie ligacji KIR MOŻE BYĆ KORZYSTNY KLINICZNIE. Współistnienie Współistnienie niezgodności dwóch typów (NK i T-komórkowej) na tej samej cząsteczce HLA: 1. Utrudnia wykazanie korzystnego wpływu niezgodności ligandów KIR 2. Utrudnia selekcję dawców z wybiórczą niezgodnością KIR Potencjalny wpływ niezgodności ligandów KIR w HSCT

60 Tylko w przypadku wystąpienia więcej niż 1 potencjalnego dawcy komórek krwiotwórczych (ABDR) można rozważać dalszą selekcję optymalnego dawcy: Polimorfizm immunogenetyczny 1. KIR 2. HLA-DPB1 3. mHag 4. Polimorfizm limfokin, chemokin, receptorów (NOD2/CARD15, IL6, IL10, TNF, IFNG, CCR5, SDF-1/CXCL12 i inne) Cechy biologiczne: 1. Status CMV 2. Płeć 3.Wiek 4. Grupa krwi AB0 5. Pochodzenie etniczne

61 Cechy biologiczne Dane pacjenta powinny być znane przed selekcją dawcy 1. Status CMV - Zgodność statusu 2. Płeć - Dawcy płci męskiej - lepsi 3. Immunizacja, - Liczba ciąż, Liczba przetoczeń 4. Wiek, - Młodsi dawcy - lepsi 5. Pochodzenie etniczne

62 Czy uwzględniać DPB1 ? A Cw B TNF LTA DRB1 DQB1 DPB1 6p % 1) 13.2% 2) 1. Tiercy et al. Bone Marrow Transplant 2000, 26(4), Hurley et al. Bone Marrow Transplant 2000, 25(4), Żalikowska-Hołoweńko. Poltransplant, Biuletyn Informacyjny Procedury zakończone doborem 10/10 alleli 3) IHiT - 80,3% - DCTK - 69,7%RR=1.77; P= Medigen - 60,4%RR=2.66; P=0, CSK WUM74,4%RR=1.40 ; NS

63 Czy uwzględniać DPB1 ? Zgodność na poziomie alleli? - raczej nie Zgodność w zakresie grup T-cell epitop (TCE)? HLA-DP niezgodne 10/10, N=2705; Shaw, Tissue Antigens 2007

64 Grupy DPB1 w zakresie TCE (T-cell epitop) 3 i 4

65 Czy uwzględniać DPB1 ? Zgodność DPB1 pomiędzy dawcą a biorcą komórek krwiotwórczych MOŻE MIEĆ ZNACZENIE KLINICZNE. Uzasadnione są dalsze badania, zwłaszcza nad wyjaśnieniem mechanizmu immunologicznego.

66 1.Nie uwzględniono etapu further typing, który zmniejsza koszty i przyśpiesza dobór 2.Nie uwzględniono jednoczesnego badania większej liczby dawców bez sprowadzania ich próbek 3.Nie uwzględniono zakresu informacji dodatkowych koniecznych do uzyskania na etapie typowania potwierdzającego dawcy (CMV, inne IDM, liczba przetoczeń i ciąż, grupa krwi, wywiad lekarski, przynależność etniczna, płeć, wiek itp.). Algorytm poszukiwania niespokrewnionego dawcy przedstawiony przez POLTRANSPLANT ma braki

67 1.Genotypowania HLA przy użyciu różnych metod o poziomie rozdzielczości odpowiednim do sytuacji znajduje zastosowanie w procedurach doboru dawców komórek krwiotwórczych. 2.Zgodność HLA 10/10 pomiędzy dawcą a biorcą KK stanowi podstawowy warunek skutecznego leczenia transplantacyjnego. 3.Dobór HLA-DPB1 może pozwolić na poprawę przeżywalności chorych, lecz również zwiększyć odsetek wznowy. Wymaga dalszych badań. 4.Korzystna niezgodność ligacji KIR zawsze wiąże się z niezgodnością T- komórkową. Wymaga istotnych modyfikacji przygotowania immunosupresyjnego pacjenta. Wnioski


Pobierz ppt "Aktualne metody typowania tkankowego, zgodność pary dawca biorca Jacek Nowak Zakład Immunogenetyki, Instytut Hematologii i Transfuzjologii, Warszawa Konferencja."

Podobne prezentacje


Reklamy Google