Pobieranie prezentacji. Proszę czekać

Pobieranie prezentacji. Proszę czekać

Diagnostyka cytogenetyczna i molekularna białaczek Jesienna Szkoła Onkologii Falenty 21-23 października 2005 Tomasz Sacha.

Podobne prezentacje


Prezentacja na temat: "Diagnostyka cytogenetyczna i molekularna białaczek Jesienna Szkoła Onkologii Falenty 21-23 października 2005 Tomasz Sacha."— Zapis prezentacji:

1 Diagnostyka cytogenetyczna i molekularna białaczek Jesienna Szkoła Onkologii Falenty października 2005 Tomasz Sacha

2 Aberracje cytogenetyczne w ostrych białaczkach Zmiany numeryczne: Hipodiploidia (mniej niż 46 chromosomów) w 10-15% OBS Hiperploidia w 5-19% OBL, 2-3% w OBS Zmiany strukturalne (>200 powtarzalnych opisanych): Bez uchwytnego związku z określonym typem białaczki - +8, -7, 7q- lub 5q- Występujące częściej w określonych typach białaczek

3 Aberracje cytogenetyczne w ostrej białaczce szpikowej – znaczenie rokownicze t(15;17) PML-RARalfa, Mbcr i mbcr (M3), t(8;21), AML-ETO (AML:20%, M2:40%)* 20-30% AML inv 16, CBF-MYH11 (M4eo)* kariotyp prawidłowy kariotyp inny, złożone aberracje Korzystne rokowniczo Pośrednie ryzyko Niekorzystne rokowniczo

4 Podział białaczek wg WHO I. Ostre białaczki szpikowe (OBS) A.OBS z określonymi zmianami cytogenetycznymi t(15;17), PML/RARalfa+ (M3 wg FAB) t(8;21), AML/ETO + (M2 wg FAB) inv 16, CBFbeta/MYH1+ (M4eo wg FAB) 11q23, MLL z wieloliniową dysplazją B.OBS o nieokreślonej specyfikacji cytogenetycznej (wg FAB) II. Ostre białaczki limfoblastyczne

5 Użyteczność metod biologii molekularnej w diagnostyce ostrych białaczek Bardzo heterogenna grupa osób z prawidłowym kariotypem, lub kariotypem others (np.40-60% AML) Zmiany submikroskopowe: aberracje wewnątrzgenowe: duplikacje, mutacje punktowe, MLL,FLT3, c-KIT,RAS małe insercje lub delecje Zmiana ekspresji genów: EVI1, BAALC, WT1

6 Translokacjamiędzychromosomami 9 i 22 Powstaje gen hybrydaBcr/Abl ChromosomPhiladelfia

7 t(9;22)(q34;q11) in the course of CML 7 YOUR LOGO HERE Department of Haematology, Collegium Medicum Jagiellonian University, Kraków, Poland XY

8 8 t(9;22)(q34;q11), BCR/ABL - FISH analysis 8

9 e19a2 b3a2 b2a2 e1a2 BCR-ABL Ib Iaa11a2a3 ABL BCR e1b3b2e19e2e1 m-bcrM-bcr -bcr

10 10

11 Całkowita ilość komórek białaczkowych Remisja hematologiczna Remisja cytogenetyczna (Ph+ = 0) Remisja molekularna Diagnoza / nawrót Ph dodatni Real-Time PCR dodatni Gniazdowa RT-PCR dodatni BCR-ABL niewykrywalny Stosunek BCR-ABL / ABL (%) Stopień redukcji patologicznego klonu komórek stwierdzanego dostępnymi metodami badawczymi - poziomy (typy) odpowiedzi.

12 Zalety konwencjonalnego badania cytogenetycznego Detekcja dodatkowych aberracji cytogenetycznych Wykrywanie resztkowej populacji zdrowych komórek hemopoetycznych Określenie charakterystycznego polimorfizmu chromosomalnego

13 Anomalie cytogenetyczne zaostrzenia CML Najczęstsze anomalie trisomia 8 izochromosom i(17) trisomia 19 dodatkowy chromosom Ph Rzadsze anomalie monosomia 7 monosomia 17 monosomia Y trisomia 17 trisomia 21 translokacja t(3;21) (q26;q22)

14 Wady konwencjonalnego badania cytogenetycznego Brak wykrywania Ph u ok. 10% chorych na CML Trudności techniczne - wymóg uzyskania odpowiedniej ilości dobrych jakościowo, dzielących się komórek. Niska czułość

15 Zalety hybrydyzacji immunofluorescencyjnej in situ (FISH) Możliwość badania ilościowego Analiza większej ilości komórek niż w klasycznej cytogenetyce Wysoka wiarygodność w ocenie odpowiedzi cytogenetycznej Materiał: krew obwodowa

16 Wady hybrydyzacji immunofluorescencyjnej in situ (FISH) Wyniki fałszywie pozytywne Badanie nieprzydatne gdy Ph w < 5-10% komórek

17 Zalety i wady RT-PCR (reakcja odwrotnej transkrypcji i polimerazowa reakcja łańcuchowa) Czułość: 10^ ^-6 - zaleta czy wada? Konieczność szczególnej kontroli: wyniki fałszywie ujemne wyniki fałszywie dodatnie Wyniki negatywne mimo CML? Trudności interpretacyjne: diagnostyczne monitorowanie leczenia

18 Introduction of Q-PCR for monitoring of Bcr-Abl moths after allo-SCT Bcr-Abl after allo-SCT detected by RT-PCR Bcr-Abl pos. Bcr-Abl neg ECMLSG: Q-PCR is appropriate method for Bcr-Abl monitoring Real-time Q-PCR is recommended as a sensitive and accurate method of MRD monitoring in CML patients treated with imatinib

19 Amplification plot of patient samples analyzed in Dept.of Haematology, Kraków by Real-Time Q-PCR AbiPrism 7700.

20 Transcript level vs positive control Bcr-Abl kinetics in CML patients in Chronic Phase treated with Imatinib - Real-Time Q-PCR Comb.Th BC

21 Metody ilościowej detekcji BCR/ABL - Q-PCR Ilość transkryptu bcr/abl we krwi obwodowej silnie koreluje z odsetkiem komórek Ph + w szpiku Wzrastająca ilość transkryptu bcr/abl we krwi obwodowej poprzedza wystąpienie nawrotu cytogenetycznego i hematologicznego.

22 Metody ilościowej detekcji BCR/ABL - Q-PCR Informacja o wzroście ekspresji BCR/ABL krytyczna dla pacjentów z alternatywnymi możliwościami leczenia (auto-, mini allo-, standardowa allotransplantacja, inne) Informacja o minimalnej ilości komórek białaczkowych istotna w przewidywaniu długotrwałej kontroli choroby Wartość prognostyczna ilości bcr/abl we krwi obwodowej po 3 miesiącach terapii Imatinibem dla uzyskania odpowiedzi cytogenetycznej (redukcja >3 log) 22

23 ImatinibBcr-AblZmutowana Bcr-Abl Ewolucja klonalna Amplifikacja/ hiperekspresja genu BCR-ABL Mutacje w domenie kinazy Wtórne zaburzenia genetyczne Wzrost komórek niezależny od aktywności Bcr-Abl Wzrost komórek zależny od aktywności Bcr-Abl von Bubnoff et al. Leukemia. 2003;17:829. Potencjalne mechanizmy oporności na imatinib

24 Miejsca mutacji w obrębie domen kinazy Miejsce wiązania ATPPętla aktywacyjna koniec karboksylowy T315I E255V E255K M244V G250E M351T L248V Y253F E279K F317L E355G F359V H396RS417YE459K Ilość pacjentów z daną mutacją Różne mutacje tego samego aminokwasu F486S Q252H P loop

25 Zależność pomiędzy występującą mutacją BCR-ABL a fazą CML French Cooperative Study Group (2004) CP AP p BP n=52 n=17 n=10 P-loop 19% 47% % T315l 15% 18% ns 40% Inne 66% 35% % średni czas trwania leczenia imatinibem 30 mcy (2-54) średni czas monitorowania leczenia 42 mce (4-54)

26 Występowanie mutacji BCR-ABL a progresja CML French Cooperative Study Group (2004) Progresja (def): zgon, faza akceleracji, faza kryzy blastycznej P-Loop i T315L Inne p (n=18) (n=34) Progresja 61% 26,5 0,019 11/18 9/34 P-Loop T315L Inne p (n=8) (n=10) (n=24) Progresja 50% 75% 26,5 ns 5/10 6/8 9/34

27 Pokonanie oporności poprzez zwiększenie dawek imatinibu French Cooperative Study Group (2004) Oceniani pacjenci odpowiedź (czas) P-loop 10/18 (56%) E255K T315I 6/11) (55%) Inne 24/40 (60%) (M244V,E275K,M351T F359V,V379I,L387M, H396R) 1/10 (10%) 0/6 11/24 (46%) CHR: 1 (2.5 mo) MCR: CCR: CHR: MCR: CCR: CHR: 7 median 16,1(6,2-29) MCR: 2 10 i 21,5 mcy CCR: 2 9 i 18 mcy

28 t(15;17) t(9;22) inv(16) Schoch et al. PNAS, 99, , 2002

29 t(15;17) t(9;22) inv(16) t(11q23)/MLL Kohlmann et al. GCC, 37, , 2003


Pobierz ppt "Diagnostyka cytogenetyczna i molekularna białaczek Jesienna Szkoła Onkologii Falenty 21-23 października 2005 Tomasz Sacha."

Podobne prezentacje


Reklamy Google