Pobieranie prezentacji. Proszę czekać

Pobieranie prezentacji. Proszę czekać

Diagnostyka laboratoryjna w endokrynologii Pracownia Naukowa Katedry i Kliniki Chorób Wewnętrznych i Endokrynologii SP CSK WUM w Warszawie Kierownik Kliniki.

Podobne prezentacje


Prezentacja na temat: "Diagnostyka laboratoryjna w endokrynologii Pracownia Naukowa Katedry i Kliniki Chorób Wewnętrznych i Endokrynologii SP CSK WUM w Warszawie Kierownik Kliniki."— Zapis prezentacji:

1 Diagnostyka laboratoryjna w endokrynologii Pracownia Naukowa Katedry i Kliniki Chorób Wewnętrznych i Endokrynologii SP CSK WUM w Warszawie Kierownik Kliniki prof. dr hab.med. Ewa Bar-Andziak Zbigniew Bartoszewicz Agnieszka Kondracka Co rzeczywiście mierzymy metodami immunochemicznymi? Przykłady interpretacji wyników dla autoprzeciwciał i hormonów białkowych. Normy, standaryzacja Oznaczanie frakcji hormonów wolnych, biodostępnych i całkowitych.

2 Stan kliniczny pacjenta a wyniki laboratoryjne PACJENT wyniki badań laborato- ryjnych stan kliniczny LEKARZ DIAGNOST A próbka NORMA KLINICZNA NORMA LABORATORYJNA Jaki materiał? Sposób pobrania? Diagnostyka Laboratoryjna Dostarcza informacji na temat stanu zdrowia chorego na podstawie badań materiału biologicznego

3 Materiał biologiczny pobierany: Metodami nieinwazyjnymi Metodami inwazyjnymi Ślina Mocz i kał Komórki nabłonka Włosy Paznokcie Naskórek Wydychane powietrze Mózgowo-rdzeniowy Wewnętrzne płyny wydzielnicze Szpik kostny Komórki i tkanki (biopsje, resekcje) Krew (surowica, osocze) Stawowy (wysiękowy) Surowiczy Owodniowy Przewodu pokarmowego Cały pacjent

4 Metody immunochemiczne (1) Wszystkie analityczne metody immunochemiczne przeznaczone są do identyfikacji antygenów i przeciwciał Ag antygenAb przeciwciało Stężenie zdecydowanej większości hormonów jest oznaczane metodami immunochemicznymi

5 Metody immunochemiczne (2) Jakie substancje chemiczne możemy oznaczać? Większość substancji istotnych z klinicznego punktu widzenia: - białka (w tym przeciwciała), peptydy glikobiałka, glikopeptydy - hormony niebiałkowe (np. tarczycy FT3,FT4), hormony sterydowe (np.DEHAE-S, kortyzol) - leki i ich metabolity, witaminy - lipidy, cukry (np.glikowana hemoglobina) - materiał genetyczny (DNA, mRNA) Każdą substancję, przeciwko której jesteśmy w stanie wyprodukować przeciwciało a w przypadku oznaczania przeciwciał jesteśmy w stanie wyizolować antygen

6 Metody immunochemiczne (3) W jakim materiale biologicznym oznaczamy ? Nazwa metodyMateriał do analizy Testy immunodiagnostyczne (immunoassay) Surowica i osocze krwi, płyny wysiękowe (np. z jamy stawowej), płyn z opłucnej, płyn mózgowo- rdzeniowy, mocz, ślina Immunocytochemia (komórki)Komórki ImmunohistochemiaTkanki, biopaty Hybrydocytochemia (technika FISH sonda znakowana fluor. DNA lub RNA preparatów mikroskopowych Bloting, bloting in situHomogenat materiału tkankowego lub komórek, tkanki

7 Metody immunochemiczne (4) Zasady działania Podstawowa zasada działania wszystkich analitycznych metod immunochemicznych polega na utworzeniu kompleksu ( wiązania) przeciwciało - antygen Warunkiem koniecznym do prawidłowego oznaczenia analitu metodą immunochemiczna jest wysoka jakości użytego przeciwciała lub/i antygenu Ag + Ab Ag-Ab kaka kdkd + Zależność od: - pH - Temp - Siły jonowej

8 1) Adsorpcja (opłaszczanie) na powierzchni fazy stałej Testy immunochemiczne heterogenne

9 Metody immunochemiczne (5) Antygen Antygenem nazywamy substancję, która sama (immunogen) lub po sprzężeniu (hapten) z odpowiednim nośnikiem po wprowadzeniu do organizmu obcego jest w stanie wytworzyć przeciwciała oraz swoiście się z nimi wiązać Antygenem może być immunogenna substancja nierozpoznawalna przez układ immunologiczny organizmu jako własna Nie każdy antygen jest immunogenem Reakcje: lektyna – determinanta cukrowa hormon-receptor nie są reakcjami immunologicznymi Autoantygeny

10 Antygeny – immunogeny w endokrynologii  „Dobre” immunogeny - duże białka Tg, TSH, NIS, rTSH, TPO  „Średnie” immunogeny – małe białka, peptydy, glikopeptydy PRL, hGH, LH. FSH, insulina  Hormony słabo lub nieimmunogenne -hormony sterydowe (T, cort, Prog, 17-OH prog), fT3, fT4 - polisacharydy Im większy ciężar cząsteczkowy antygenu i bardziej zróżnicowana jego struktura tym lepszym jest immunogenem

11 N  Glikozylacja  Fosforylacja i sulfatacja  Deamidacja  Proteoliza  Tworzenie się agregatów Zmienność antygenów – izoformy 1.Różne kopie genów (splicing) 2.Postranslacyjne modyfikacje 3. Epitopy  ciagłe 3-6 aa  nieciągłe (przestrzenne) aa

12 Odpowiedź humoralnaOdpowiedź komórkowa Typy odpowiedzi immunologicznej Metody immunochemiczne (6)

13 Produkcja przeciwciał Przeciwciała Ig G (KLH) –keyhole limpet hemocyanin (BSA )– bovine serum albumin Antygen (hapten) + nośnik Immunogen Immunogen + emulgator sprzęganie Kolejne immunizacje Podstawowe cechy „dobrego” przeciwciała:  selektywność (swoistość) do antygenu (k a )  brak reakcji krzyżowych ze związkami zbliżonymi strukturalnie do antygenu  niskie wiązanie niespecyficzne (NSB) Przeciwciała poliklonalne Przeciwciała monoklonalne Hodowla szpiczaka

14 FcFc Fab E2 E1 Znacznik Cechy znakowania:  ilość, jakość znacznika zwiększająca czułość  znakowanie nie powinno zmieniać własności przeciwciał (selektywność, siła wiązania, reakcje krzyżowe) oraz antygenu (maskowanie epitopów, struktura przestrzenna)

15 Ligandy: biotyna, awidyna, digoksygenina, lektyny Rodzaje techniki pomiarowej - znaczniki Rodzaj znacznikaNazwa metody Bez znacznika Immunoelekroforeza, immunodyfuzję radialną. neflometria, turbidymetria – bezpośredni pomiar kompleksu immunologicznego Radioizotopy: J 125, Co 57, H 3, C 14 RIA - (RadioImmunoAssay - radioimmunologiczna) IRMA (ImmunoRadioAssay - immunoradiometr.) Enzymy: fosfataza alkaliczna, peroksydaza chrzanowa,  -D- galaktozydaza EIA- (EnzymeImmunoAssay - immunoenzymatyczna) Fluorofory: fluresceina, kumaryna,europ Eu +3, terb Tr +3 FIA- (FluorecsenceImmunoAssay) Luminofory: estry akrydyny, pochodne izoluminolu LIA / CLIA - (ChemiLuminescenceImmunoAssay) ECL / ECLIA - (Ele ktroChemiLuminescenceImmunoAssay)

16 Liniowość metod (zakres pomiarowy) ECLLIAFIAEIARIA

17 Testy I generacji -< 1,0  U/ml Testy II generacji-< 0,1  U/ml Testy III generacji-< 0,01  U/ml Testy do oznaczania TSH Kolejne generacje testów w zależności od czułości analitycznej

18 Test bezpośredni Ag (immunohistochemia)

19 + Ag+ Ab Ag-Ab + Ag-Ab + IIAb Ag-Ab-IIAb* znakowane przeciwciało anty-Ab Test pośredni Ag (immunohistochemia)

20 + Ag+ Ab Ag-Ab + Ag-Ab + IIAb Ag-Ab-IIAb* znakowane przeciwciało anty-Ab Test Pośredni Ab (autoprzeciwciała tarczycy) TPO aTPO Zastosowanie: Oznaczanie autoprzeciwciał

21 Test i producent Wynik Negatywny Pozytywny Zakres pomiarowy ATG Diamed (ELISA) Cogent Diagnostics(ELISA) Brahms (LUMItest) Abbott/AXSYM (MEIA) Roche/ELECSYS (ECLIA) 190 IU/ml 325 IU/ml < 115 U/ml < 34 IU/ml < 115 IU/ml 60 – 5000 ? 5 – – 4000 ATPO Diamed (ELISA) Cogent Diagnostics (ELISA) Brahms (LUMItest) Abbott/AXSYM (MEIA) Roche/ELECSYS (ECLIA) 190 IU/ml 24 IU/ml < 60 U/ml < 12 IU/ml < 63 IU/ml 30 – 2500 ? 5,5 – TBII (TRAb) Brahms (LUMItest TRAK) Roche/ELECSYS (ECLIA) 1,5 IU/l 1,75 IU/l 0,1 – 40 0, Normy dla ATPO, ATG i TBII

22 Czynniki wpływające na wartości referencyjne (norma, wartości odcięcia, wartości graniczne, wartości decyzyjne)  Czynniki genetyczne (rasa) dh.alk.  Wiek, płeć (T, PRL)  Czynniki środowiskowe(ATG)  Cykl dobowyACTH, kortyzol, PRL, GH  Otyłość zmienia dobowy rytm ACTH, kortyzol  Niedożywienie oraz dieta wegetariańska  Aktywność, pozycja ciałaaldosteron  Stres i stany pooperacyjne podwyższają stężenie ACTH i kortyzolu w ciągu 15 min, normalizacja następuje w 8-10 godz. po ustaniu stresu.  Doustna antykoncepcja czy HTZ u kobiet zmieniają wyniki oznaczeń tyroksyny i kortyzolu  Warunki laboratoryjne (gł. metody manualne)

23 Czynniki wpływające na zróżnicowanie wyników antyTPO i antyTG 1. Tozzoli, R. et al. (2002). Clin. Chem. Lab Med., Jun; 40(6):  Natura autoprzeciwciał  Trudność z definiowaniem stężenia odcięcia dla wyników pozytywnych  Brak międzynarodowych wzorców  Zróżnicowanie metod otrzymywania autoantygenu  Różnorodność analityczna w procedurach testów (np. typ płukania 1 lub 2-stopniowe wpływa na dokładność wyników)

24 Zróżnicowanie metod otrzymywania autoantygenu  Antygeny otrzymywane z tkanki zwierzęcej  Antygeny rekombinowane  Antygeny ludzkie hTPO aTPO TPO

25 Metody z ograniczona ilością przeciwciała ( kompetycyjne) + + AgAb-Ag Ab+ Ag*Ab-Ag* Niedomiar przeciwciała wychwytującego Zastosowanie: niskocząsteczkowe hormony sterydowe, T3, T4, PRL

26 Metody z nadmiarem odczynnika metody niekompetycyjne - kanapkowe (sandwich assay) + + Ab1+Ag Ab1-Ag Ab1-Ag+ Ab2* Ab1-Ag-Ab2* Nadmiar przeciwciała wychwytującego Zastosowanie np. Intact PTH E1 E2 E1 E2

27 Co chemy a co rzeczywiście mierzymy metodami immunochemicznymi? Pomiar Stężenie Hormonu A Cel Czy hormon A jest homogenny? Czy przeciwciała użyte w teście rozpoznają substancje inne niż hormon A? Interferencje

28 Interferencje w metodach immunochemicznych Interferencje w diagnostyce laboratoryjnej można określić jako wpływ substancji obecnej w próbce badanej, polegający na zmianie prawidłowej wartości wyniku danego parametru wyrażonego zwykle jako stężenie lub aktywność  Efekty matrycowe (im mniejsza objętość próbki w stosunku do mieszaniny reakcyjnej tym mniejsze prawdopodobieństwo interferencji  Heterogenność oznaczanego analitu w próbce  Reakcje krzyżowe – wiązanie się przeciwciała z substancją inną niż analit  Czynniki wpływające na zmianę stężenia hormonu (np. leki, stres, infekcje, alergie, zakażenia, dieta)

29 Heterogenność hormonów Hormon A Agregaty i prohormony Produkty degradacji Izoformy o podobnym ciężarze cząsteczkowym W jakim stopniu heterogenny hormon A jest rozpoznawalny w teście immunochemicznym ? Wynik? Autoprzeciwciała, przeciwciała heterofilne białka wiążące Enzymy proteolityczne metabolity glikozylacja, fosforylacja

30 Heterogenność oznaczanego hormonu (1) (PRL) Roche Elecsys Beckman Access

31 IZOFORMY PROLAKTYNY CIĘŻAR CZĄSTECZK OWY (kDa) AKTYWNOŚĆ BIOLOGICZNA (liczona względem formy monomerycznej) WYSTĘPOWANIE i WŁASNOŚCI Fragmenty Proteolityczne Monomeryczne Podstawowa „little PRL” Glikozylowana ? 100% zwykle niższa lub niezmieniona Wiąże się z krótką rozpuszczalną formą receptora PRL Zwykle stanowi 85%-95% całkowitej PRL w surowicy ludzi zdrowych Może być formą dominującą w trzecim trymestrze ciąży. W hiperprolaktynemii jej ilość maleje wraz z nasileniem objawów Agregaty Dimery „big PRL” (b- PRL) duża cząsteczka PRL Niższa lub porównywalna Do 10% całości prolaktyny w surowicy, gł. dimery „big-big PRL” (b- b.PRL) bardzo duża cząsteczka PRL „ultra big PRL makroprolaktyna (kompleksy PRL z przeciwciałami IgG) > lub > Mniejsza lub nawet zerowa w porównaniu z monomeryczną PRL Dominujące w ok. 25% hiperprolaktynemii idiopatycznej, 2.9% ciąży (3 trymester), obecne w prolaktinoma Heterogenność oznaczanego hormonu (2)

32 Podwyższony poziom prolaktyny w surowicy: - Precypitacja 1:1 surowicy z 25% PEG-6000 % PEG 6000 w stos. 1+1  po 10 min. odwirować przy 2000g przez 5 min.  oznaczyć w supernatancie poziom prolaktyny  obliczyć % odzysku w stos. do próbki natywnej: [stęż. PRL po precyp. z PEG] x 2 [stęż. PRL po precyp. z PEG] x 2 % odzysku = 100 x % odzysku = 100 x [stęż. PRL w próbce natywnej] [stęż. PRL w próbce natywnej] Oznaczanie makroprolaktyny metodą z PEG-iem (1) Heterogenność oznaczanego hormonu (3)

33 Heterogenność oznaczanego hormonu (5) Degradacja hormonów pod wpływem enzymów proteolitycznych Enzymy proteolitycze Test kompetycyjny A C B Epitop 1 Epitop 2 A + C A + B E2 E1 Który fragment jest bioaktywny? E1E2 Który fragment ma znaczenie diagnostyczne?

34 Heterogenność oznaczanej substancji (6) Degradacja hormonów pod wpływem enzymów proteolitycznych Enzymy proteolityczne Test kanapkowy A C B Epitop 1 Epitop 2 A + C Tylko A E1 E2 E1 E2 Epitop 2 E2

35 Degradacja cząsteczki PTH pod wpływem enzymów proteolitycznych Pre-proPTH Intact-PTH (i-PTH) 1-84 N C C-PTH C N N-PTH 1-34 Mid-molecule PTH Brak aktywności biologicznej bioaktywny 7-84 C Nagromadza się w niewydolności nerek

36 Pro-opiomelanokortyna ( POMC) Pro-ACTH  LPH N-POCACTHJP  3 -MSH αMSHCLIP  LPH β-EP PC1 PC Oddziaływania z prekursorami hormonów (pro-hormonami) N--C Człowiek Inne ssaki ACTH Degragacja cząsteczki proopiomelanokortyny (POMC) przez konwertazy prohormonalne PC1 i PC2

37 Aktywność biologiczna prekursorów i fragmentów hormonu adenokortykotropowego (ACTH) ACTH 1 39 N- -C  Propiomelanokortyna (POMC) niska aktywność biologiczna  pro-ACTH % bioaktywności ACTH w zależności od metody pomiaru 100% bioaktywności % bioaktywności Niska bioaktywność ale ma wpływ na okres połowicznego rozpadu ACTH 1 24 (1-24) ACTHSyntetyczny ACTH (synacthen) 100 % bioaktywności

38 Reakcje krzyżowe Nawet najlepsze przeciwciała nie są całkowicie selektywne i mogą dawać reakcje krzyżowe z antygenami o zbliżonej budowie Metody eliminacji reakcji krzyżowych:  izolacja ligantu przed oznaczniem (ekstr. peptydów na kol. Sep-PAK)  zmiana warunków reakcji (temperatury, czasu inkubacji)  destrukcja substancji interferującej  zmiana przeciwciał na bardziej swoiste

39 Hormony Co rzeczywiście mierzymy metodami immunochemicznymi?  Hormony  Ich prekursory (prohormony)  Produkty proteolitycznego rozpadu  Agregaty  Hormony zmutowane  Hormony homologiczne  Inne anality reagujące z przeciwciałami używanymi w teście

40 Czy z medycznego punktu widzenia możliwe jest aby pacjentka w tym samym dniu miała dwa diametralnie różne wyniki poziomu prolaktyny przy prawidłowo działającym sprzęcie ? W jednym laboratorium wynik stężenia PRL pacjentki o godz 9:23 wyniósł 33,28 ng/ml W tym samym dniu o godz 10:27 w innym laboratorium wynik stężenia PRL tej samej pacjentki wyniósł 111,41 ng/ml Czy znane były warunki pobrania krwi do oznaczeń dla obu laboratoriów? Czy ustalono producenta i rodzaj testów do oznaczeń prolaktyny zastosowanych w obu laboratoriach? Czy sprawdzono wyniki kontroli wewnętrznej oraz kalibracji prolaktyny dla tych testów, na którym wykonano oznaczenie prolaktyny pacjentki w obu laboratoriach w dniu oznaczenia?

41

42 Cechy idealnego międzynarodowego wzorca dla hormonów białkowych  Powinien być czysty chemicznie i trwały (uwaga na glikobiałka)  Powinien odzwierciedlać możliwą heterogenność hormonów (różny poziom pro-hormonów, podjednostki, fragmenty, kompleksy, podtypy)  Powinien być łatwo i przez długi okres dostępny  Stężenie powinno być wyrażone w jednostkach układu SI (mole/l) lub jednostkach międzynarodowych U/l Jednostki zajmujące się standaryzacją: - Expert Comittee on Biological Standarization (ECBS) przy WHO - Institute for Reference Materials and Measurments (IRMM) - Bureau Communautaire de Reference (BCR) - National Institute for Biological Standards and Control (NIBSC) - National Comittee for Clinical Laboratory Standarization (NCCLS)

43 Standardy i kalibratory Pierwotny materiał referencyjy materiał wykazuje własności na tyle homogenne i dobrze zdefiniowane aby mógł służyć do kalibracji aparatu, oceny pomiaru lub ustanowienia wartości. Może to być czyste białko (rekombinowane lub oczyszczone ze zlewkowej surowicy ludzkiej) według jednoznacznie opisanej procedury. Powinien mieć długą trwałość a jego ilość przygotowana jednorazowo powinna wystarczyć na minimum kilkanaście np.30 lat. Wartości tego białka określone są metodami definitywnymi ( metody najbardziej precyzyjne zgodne z aktualnym stanem wiedzy nadające się dla wszystkich wzorców Drugorzędowy materiał referencyjny jego wartości odpowiadają standardowi pierwotnemu ale są określone przy zastosowaniu metod referencyjnych (np. metoda rozcieńczeń izotopowych połączonej z GC i MS (ID-GCMS). Pożądane własności : akceptowalny (certyfikowany) na forum międzynarodowym ( np. hormony: LH, FSH, PRL, TSH); szeroko dostępny, stabilny i dobrze sprecyzowany możliwie oparty na surowicy ludzkiej o własnościach zbliżonych do substancji natywnych w surowicy o podobnych własnościach dla różnych metod; otrzymywany w precyzyjnie ustalonych protokołach produkcji Materiały kontrolne (kalibratory, standardy firmowe) np. dla T, Prog., Estriolu, FT3, FT4). Służą do rutynowej wewnętrznej kontroli jakości: krótszy okres trwa- łości (kilka miesiecy) gorzej sprecyzowane i akceptowalne na zewnątrz laboratorium

44 Przeciwciała stymulujące w chorobie G-B M. Jakóbisiak 1998 R. Di Lauro, M. De Felice 2001

45 Thyrotropin receptor autoantibodies (TRAbs) AutoantibodyMechanism of actionClinical effect Stimulating the thyroid TSI (thyroid stimulating immunoglobulins) TSAb (thyroid stimulating antibodies) Stimulating TSH-R in substitution of TSH or incrasing the TSH effectiveness, increasing the receptor half-life Hyperthyroidism in G-B Hyperthyroidism of infants Blocking the thyroid stimulation TBAb (thyroid blocking antibodies) TSBAb (thyroid stimulating-blocking antibodies Blocking the TSH-R activation by TSH and stimulatory antibodies. Blocking the binding the TSH and antibodies to TSH- R Present in different autoimmune thyroid inflamation, in majority of patients with G-B, May produce hypothyroidism Blocking the binding of TSH to TSH-R TBII (TSH binding inhibitory immunoglobulins) TBIAb (TSH binding inhibitory antibodies) Blocking the binding of TSH to its receptor. Can stimulate or inhibit the receptor activity by ligands Present in G-B, autoimmune thyroid diseases Stimulation the thyroid growth TGI (thyroid growth immunoglobulins, thyroid growth stimulating immunoglobulins) Questionable. There is no evidence that TSH-R is the only antigen, cAMP is not a messenger. Present in G-B Inhibit the thyroid growth TGI-block (thyroid growth immunoglobulin blocking There is no evidence that the TSH-R is an antigen Present in hypothyroidism NeutralBinds TSH-R but doesn’t influence its function Present in G-B, lack in healthy individuals MultifunctionalBinds TSH-RNot known

46 Pomiar stężenia przeciwciał TBII (kompetycyjne) + + Niedomiar związanego przez MAb natywnego TSH-R + + nTSH-R TSH nTSH-R MAb TSH TBII – przeciwciała blokujące miejsce wiązania TSH do jego receptora

47 TPO i TG są głównymi autoantygenami AITD Nohr S.B. et al. J Clin Endocrinol Metab 2000;85: TPO Tg Enzym konieczny do syntezy T3 i T4 Białko na którym T3/T4 są syntetyzowane Przeciwciała generowane w chorobach tarczycy:  Choroba Hashimoto  Choroba Graves’a Peroksydaza Tarczycowa Tyreoglobulina

48 Metody kompetycyjne a niekompetycyjne (1) Wszystkie immunochemiczne metody kompetycyjne opierają się na pomiarze niezajętych przez analit miejsc na cząsteczkach przeciwciała wychwytującego Znakowany antygen Analog antygenu Przeciwciało blokujące

49 Metody kompetycyjne a niekompetycyjne (2) Wszystkie immunochemiczne metody niekompetycyjne opierają się na pomiarze zajętych przez analit miejsc na cząsteczkach przeciwciała wychwytującego


Pobierz ppt "Diagnostyka laboratoryjna w endokrynologii Pracownia Naukowa Katedry i Kliniki Chorób Wewnętrznych i Endokrynologii SP CSK WUM w Warszawie Kierownik Kliniki."

Podobne prezentacje


Reklamy Google