Alternatywny splicing

Prezentacja na temat: "Alternatywny splicing"— Zapis prezentacji:

1 Alternatywny splicing
Wyjątek, który może być regułą? *Przedstawienie się *Tematem seminarium jest alternatywny splicing *Czym jest w aspekcie molekularnym, jak jest regulowany, jakie są relacje pomiędzy nim a splicingiem konstytutywnym. Kamil Lipiński

2 Splicing jako potranskrypcyjna modyfikacja mRNA
Splicing konstytutywny (‘constitutive’)* Splicing alternatywny (‘alternative’) Tak miej więcej wygląda pokutujące w dzisiejszych podręcznikach akademickich wyobrażenie na temat alternatywnego splicingu. Splicing całościowo dzieli się na tzw. konstytutywny, spełniający regułę: jeden gen – jedno białko, oraz na tzw. splicing alternatywny wymykający się spod tej reguły… Istnieje pewne przekonanie, ściśle rzecz biorąc wyłącznie intuicyjne, jakoby obie alternatywny splicing wprowadzał wprowadzał w ekspresji informacji genetycznej całkiem nową jakość, jakby był wyjątkiem od powszechnie panującej reguły zwykłego splicingu, a co za tym idzie, jakby istniał jakiś specjalny mechanizm nadający genom niezwykłą możliwość przetasowywania swoich transkryptów. Nic bardziej mylnego. W swojej prezentacji chciałbym pokazać wręcz zupełnie przeciwną interpretację relacji pomiędzy jednym i drugim. Izoformy *W ‘Molecular Biology of the Gene’ w ramach splicingu alternatywnego wyróżnia się alternatywny splicing regulacyjny oraz konstytutywny, co ma zupełnie inne znaczenie. W tej samej publikacji podzielono jednocześnie cały splicing na konstytutywny i alternatywny, analogicznie jak w powyższy schematach. Schematy: „Genoms” T. A. Brown, 2001

3 Sekwencja intronu a splicing
Sekwencje konserwatywne w intronach kręgowców Conajmniej 15%, a być może nawet do 50% ludzkich chorób genetycznych powstaje na skutek mutacji albo w miejscach splicingowych albo w innych elementach warunkujących poprawnych splicing* Ogólny schemat składania mRNA Sekwencja intronu, na przekór lansowanemu powszechnie przekonaniu, nie jest całkowicie bez sensu, w sensie, że jest losowa. Owszem, zdecydowana większość zasad mogłaby być z powodzeniem zastąpiona bez zmiany efektu. Ale, do poprawnego cięcia i składania mRNA wymagane są pewne sekwencje konserwatywne, zapewniające wycięcie intronu. Sekwencje są trzy, jakby się uprzeć cztery (A). Rozpoznanie przez maszynerię zawiadującą splicingiem miejsc splicingowych jest nie małym wywaniem dla komórki. Przeciętny ludzki gen zawiera około 8-9 eksonów, którego średnia długość to około 150 nt, zaś intonu kilka tysięcy. Są także introny zawierające kilkaset tysięcy nt. Spliceosom musi więc zdefiniować niewielkie eksony w morzu sekwencji intronowych. Aby zilustrować wagę dokładnego wyboru miejsc splicingowych można przytoczyć statystykę, z artykułu z Nature, w którym podano, że według badań prowadzonych od 2002 roku, co najmniej 15% do nawet 50% ludzkich chorób genetycznych jest spowodowanych mutacjami albo w miejscach splicingowych albo też w sekwencjach silencerów i enhancerów splicingu. Wydaje się to wręcz nieprawdopodobne. Postanowiłem nieco zagłębić się w temat, rzecz nie ma się tak dosłownie, uważam że nie należy traktować pochopnie tego oszacowania zbyt poważnie. *Understanding alternative splicing: towards a cellular code, Nature reviews: 2005 „Genoms” T. A. Brown

4 Spliceosom - rola snRNP
Rozpoznanie miejsc cięcia i składania zachodzi na zasadzie hybrydyzacji snRNA z sekwencjami konserwatywnymi w intronach. Motywy te mogą znajdować się wewnątrz eksonu czy intronu przypadkowo (miejsca kryptyczne). Musi zatem istnieć mechanizm zapewniający ich ignorowanie. *Decydującą rolę w rozpoznawaniu motywów sekwencyjnych sugerujących występowanie w danym miejscu intronu ma snRNA, element rubonukleinowy snRNP. Białka snRNP mają głównie funkcję asocjacji kompleksu, zawinięcia mRNA w pętlę oraz oczywiście funkcję katalityczną, co doprowadza (w reakcji transestryfikacji) do wytworzenia lariatu i złożenia sąsiednich eksonów. *Cięcie i składanie następuje jedynie wówczas, gdy odpowiednie konserwatywne motywy w sekwencjach flankujących intron w mRNA zostaną rozpoznane przez elementy spiceosomu. Funkcję sondy pełni snRNA w rybonukleoproteinach U1 i U2. Hybrydyzacja snRNA z miejscem donorowym (GU) oraz miejscem rozgałęzienia (A) powoduje przyłączenie całego snRNP, powstaje tzw. kompleks aranżujący (H complex) i w konsekwencji kolejny etap, jakim jest asocjacja całego kompleksu splicującego, czyli spliceosomu. Jak widać, jedyne znaczenie ma tu obecność lub brak odpowiedniego motywu sekwencyjnego, nie zaś jakiekolwiek zewnętrzne (np. epigenetyczne) wyznaczniki, gdzie intron/ekson się kończy, a gdzie zaczyna. Ponieważ motywy są krótkie, mogą się pojawiać także wewnątrz eksonów czy intronów, jako tzw. miejsca kryptyczne, które spliceosom musi zignorować. Takich miejsc jest multum, niektóre mają sekwencję nawet silniejszą od preferowanych miejsc splicingowych. Oznacza to, że tzw. intronowe sekwencje konserwatywne są niewystarczające dla wyznaczenia przez spliceosom właściwych granic intron-ekson. Musi istnieć dodatkowy mechanizm zapewniający kontrolowany wybór miejsc splicingowych. „Biochemia” Streyer, 2005

5 Mechanizm wyboru miejsc cięcia i składania
Elementy ‘cis-acting’ Elementy ‘trans-acting’ Sekwence konserwatywne w intronach Sekwencje posiłkowe (‘auxiliary elements’) snRNP spliceosomu Trakt polipirymidynowy (PPT) Silencery Czynniki splicingowe Miejsca donorowe Enhancery Represory splicingu Miejsca akceptorowe Jak wygląda mechanizm zawiadujący doborem miejsc cięcia i składania, a więc rozpoznaniem lub nie miejsc splicingowych, co oczywiście prowadzi do określenia przez spliceosom co jest intronem i należy to wyciąć, a co eksonem i należy to pozostawić. Generalnie tak jak na każdym poziomie regulacji ekspresji genów elementy takiego mechanizmu można podzielić na działające w cis i w trans. Elementami w cis są po prostu odpowiednie sekwencje w pre-mRNA… W sekwencji genu, a więc i pre-mRNA nie ma żadnych jednoznacznych wyznaczników, czy o charakterze epigenetycznym czy też jakimkolwiek innym, które wyznaczałyby gdzie kończy się ekson a zaczyna intron, czy też vice versa. Same sekwencje nie wystarczą. Dopiero połączone działanie elementów w cis i w trans powoduje jedno znaczą determinację ostatecznego kształtu dojrzałego transkryptu. Wybór jest więc dynamiczny i dokonywany za każdym razem gdy pojedynczy transkrypt ulega splicingowi. Aktywatory splicingu Miejsca rozgałęzienia Schemat: projekt własny, na podstawie danych z różnych pozycji w bibliografii

6 Mechanizm wyboru miejsc cięcia i składania
Rekrutacja białek regulacyjnych (czynników splicingowych) na pre-mRNA wpływa na rozpoznawanie miejsc cięcia i składania mRNA przez snRNP spliceosomu. Sekwencje rozpoznawane przez czynniki splicingowe – to elementy posiłkowe (‘auxiliary elements’) Dzieląc splicing na konstytutywny i alternatywny, wcale nie chodzi o to ile wariantów może powstawać, bo i tu i tu może i powstawać tyle samo. Chodzi o to ile ich faktycznie powstaje (funkcjonalnych białek). Dlaczego kiedyś wyjątek dzisiaj jest regułą? Otóż, wcale nie chodzi mi o to, że według szacunków około 60-70% genów człowieka ulega alternatywnemu splicingowi, a średnio na każdy jeden gen przypadają 2-3 alternatywne mRNA. Należy jednak zaznaczyć, że u niższych eukariotów nie jest to tak częstym zjawiskiem. Chodzi mi o to, że alternatywne składanie mRNA w genach nieciągłych może zachodzić zawsze. Jednokierunkowy, konstytutywny splicing zachodzi tylko wtedy/dlatego, że nad wyborem jednego schematu składania czuwa właściwy mechanizm regulacyjny. Jeśli zawiedzie, na bazie jednego genu będą powstawać przeróżne mRNA, zarówno właściwy, jak i inne nieprawidłowe, które będą ulegać degradacji na poziomie RNA lub też nieprawidłowego białka. Przy genach mających determinować kilka wersji, mechanizm regulacyjny poszerza wachlarz możliwości. Tak więc, zgodnie z tym rozumowaniem, to konstytutywny splicing jest wyjątkiem od splicingu alternatywnego. Sekwencje rozpoznawane przez czynniki splicingowe: ESE – ‘exonic splicing enhancer’ ISE – ‘intronic splicing enhancer’ ESS – ‘exonic splicing silencer’ ISS – ‘intronic splicing silencer’ „Protein Diversity from Alternative Splicing. A Challenge for Bioinformatics and Post-Genome Biology” Douglas L. Black, Cell 103:368, 2000

7 Rola czynników splicingowych
Rekrutacja białek regulacyjnych (czynników splicingowych) na pre-mRNA wpływa na rozpoznawanie miejsc cięcia i składania mRNA przez snRNP spliceosomu. Białka z rodziny SR i hnRNP PTB / hnRNPI „35” to U2AF35, posiłkowe białko spileosomu, wiąże się z miejscem akceptorowym „65” to U2AF65, jak powyżej, wiąże się z traktem polipirymidynowym. Przykładem na powyższe białko SR jest ASF/SF2. PTB należy do rodziny hnRNP, zawiera domenty RRM wiążące się z traktem polipirymidynowym, stąd nazwa. Konkuruje więc z U2AF65. NLS – sygnał lokalizacji jądrowej. RRM3 i 4 rozpoznaje CUCUCU* *RRM – „RNA Recognition Motif” Schemat:

8 Mechanizmy aktywacji i represji
PTB wypętla ekson N1 w ssaczym genie src, co powoduje jego pominięcie Z pre-mRNA genu tat wirusa HIV1 powstają dwa warianty mRNA. Proporcja zależy od względnej ilości/aktywności hnRNPA1 i SF2/ASF #Przykładem złożonego interakcyjnie działania PTB jest ssaczy gen src, który wykazuje tkankowo specyficzny splicing. Rzecz dotyczy eksonu N1, który ulega pominięciu w neuronach. W komórkach innych niż nerwowe przyłączenie czterech PTB do downstremowych i upstremowych traktów polipirymidynowych powoduje wypętlenie eksonu N1 wraz z sąsiadującymi intronami i zbliżenie przestrzenne sekwencji akceptorowej i donorowej sąsiednich intronów. Natomiast w komórkach nerwowych tkankowo specyficznie obecne jest inne podobne białko nPTB, które jest wynikiem ekspresji paralogu genu PTB. nPTB ma słabsze właściwości represyjne, na tyle słabe, że wpływ pozytywnie działających czynników przeważa, co skutkuje rozpoznaniem miejsc flankujących ekson N1. Główne znaczenie dla pominięcia eksonu wydaje się mieć struktura drugorzędowa mRNA. Oprócz regulacji splicingu poprzez syntezę odmiennych czynników splicingowych, obserwuje się także regulację za pomocą ich fosforylacji, czemu towarzyszy zmiana aktywności czynnika bądź eksport do cytoplazmy. #Gen tat wirusa HIV ulega alternatywnemu splicingowi z wytworzeniem dwóch wariantów mRNA. Powstaje strefa wyciszenia. Schemat: na podstawie „Understanding alternative splicing (…)”, Nature reviews, 2005

9 Poziomy zjawiska w jednym rodzaju komórek:
Poprzez alternatywny splicing z jednego pre-mRNA danego genu powstają różne warianty mRNA (zazwyczaj więc różne izoformy białek): w jednym rodzaju komórek: - gen receptora DSCAM Drosophila - antygeny t/T wirusa SV40 w komórkach różnego rodzaju (tkanki): gen α-tropomiozyny szczura src ssaków w komórkach różnych osobników tego samego gatunku: - sxl, tra, tra-2, dsx - determinacja płci u Drosophila melanogaster

10 Klasyfikacja Pominięcie eksonu (‘exon skipping’) - sxl, dsx Drosophila
- gen α-tropomiozyny szczura - src ssaków Zatrzymanie intronu (‘intron retention’) Alternatywne 5’końcowe miejsce Alternatywne 3’końcowe miejsce - tra Drosophila - gen antygenu T/t SV40 Wybór jednego z eksonów - gen receptora DSCAM Drosophila Istnienie przeróżnych możliwości alternatywnego składania mRNA daje niebywałe pole do popisu ludziom lubiącym wszystko poszufladkować (ja tez się zaliczam) A ponieważ klasyfikacja jak zawsze sprawia wiele trudności i nieporozumień, właściwie gdzie nie zajrzeć tam inna koncepcja. Co do pierwszego przykładu istnieje dziś tendencja do nazywania tego alternatywnego wycinanego eksonu mianem „kasety eksonowej”. Sugeruje się stosować natomiast pojęcia „pominięcia eksonu” oraz „eksonu kryptycznego” zależnie od głównej obserwacji. Zmiany jakie wprowadza alternatywny mogą być przeróżnego rodzaju: introdukcja kodonów stop, co może powodować powstanie niefunkcjonalnej formy białka (sxl) lub powstania krótszej formy (dsx, antygen t/T) lub też skierowanie mRNA na drogę NMD, co prowadzi do bezproduktywnej ekspresji genu. Dodanie dodatkowej lub zmiana istniejącej części białka, co może skutkować zarówno w bardzo subtelnych zmianach właściwości, jak i w zmianach struktury przestrzennej, właściwości katalitycznych, wiązania się z RNA, DNA czy innymi białkami, zmianach w lokalizacji białka (domeny transbłonowe w Ig), stabilności białka, etc. Warto więc zauważyć jak wszestronnym jest mechanizmem regulacyjnym, na przykład w porównaniu do regulacji ekspresji na poziomie transkrypcji, gdzie regulowana intensywność (lub brak) syntezy mRNA oraz ewentualnie N- i C-końcowe domeny białek poprzez eksprymowanie transkrypcji z innego promotora lub wybór miejsca terminacji Schemat:

11 AS w genie antygenu T/t wirusa SV40
Splicing antygenu T/t wirusa SV40 Zidentyfikowany czynnik splicingowy, odpowiedzialny za wybór 5’ miejsca, nazwano ASF (‘alternative splicing factor’). Czynnik ten okazał się być tym samym, co SF2 - czynnikiem biorącym udział we wczesnym etapie asocjacji spliceosomu na wielu różnych pre-mRNA różnych genów. Przykład wyboru alternatywnego 5’ miejsca do wspólnego 3’ miejsca ASF/SF2 jest białkiem z rodziny SR. Zwiększona koncentracja promuje wybór 5’ miejsca najbliższego do 3’ miejsca. Obie izoformy powstają w zakażonej komórce w określonej proporcji. Schemat: na podstawie „Genes VIII”, Benjamin Levin, 2004

12 AS α-tropomiozyny szczura
Izoformy tropomiozyny powstają w wyniku pomijania eksonów (‘exon skipping’) Izoforma białka powstającego w wyniku ekspresji genu zależy od rodzaju komórki, a więc w różnych tkankach powstają różne warianty mRNA. Oznacza to, że mechanizm regulujący alternatywny splicing tego genu jest tkankowo specyficzny. Schemat:

13 AS genu DSCAM Drosophila
Każdy mRNA będzie zawierał jedną z: 12 możliwych alternatyw dla eksonu 4 (czerwony) 48 możliwych alternatyw dla eksonu 8 (niebieski) 33 możliwych alternatyw dla eksonu 9 (zielony) 2 możliwych alternatyw dla eksonu 17 (żółty) DSCAM – „Dawn syndrome cell adhesion molecule’, to receptor błonowy neuronów, odpowiedzialny za kierunkowy wzrost wypustek aksonowych (‘axon guidance receptor’), dzięki czemu możliwe jest tworzenie połączeń neuralnych w zwojach nerwowych Proporcje nie zostały zachowane. Górna ścieżka pokazuje wyróżnione 4 eksony ulegające alternatywnemu splicingowi. Pętle w ścieżce białka to domeny. Żółty pasek to domena transbłonowa. W efekcie daje to możliwości powstania 38,016 różnych mRNA i białek „Protein Diversity from Alternative Splicing. A Challenge for Bioinformatics and Post-Genome Biology” Douglas L. Black, Cell 103:368, 2000

14 AS w determinacji płci somatycznej Drosophila
Specyficzne dla płci alternatywne wycinanie intronów z pre-mRNA sxl Gen podlega samoregulacji: wczesne białko SXL powoduje pominięcie eksonu 3 w mRNA późnego białka SXL (prowadzi do represji splicingu) sxl – (‘sex lethal’) nadzędny gen regulatorowy somatycznej determinacji płci Schemat: projekt własny, na podstawie danych z różnych pozycji w bibliografii

15 AS w determinacji płci somatycznej Drosophila
SXL promuje wybór kryptycznego 3’ miejsca splicingu wewnątrz eksonu 2. TRA powoduje pominięcie eksonu 4 w mRNA dsx, zawierającego kodon stop. Zarówno krótsza jak i dłuższa izoforma DSX jest funkcjonalna. DSX(F) i DSX(M) są regulatorami transkrypcji genów wykonawczych Schemat: projekt własny, na podstawie danych z różnych pozycji w bibliografii

16 Bibliografia „Genetyka molekularna” , praca zbiorowa pod redakcją Piotra Węgleńskiego, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2006 „Genomy”, T. A. Brown, przekład pod redakcją Piotra Węgleńskiego, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2001 „Protein Diversity from Alternative Splicing. A Challenge for Bioinformatics and Post-Genome Biology”, Douglas L. Black, Cell 103:368, 2000 „Molecular Biology of the Gene, fifth edition”, James D. Watson et al.., 2004 „Genes VIII”, Benjamin Lewin, 2004 Understanding alternative splicing: towards a cellular code”, Arianne J. Martiln, Francis Clark, Christopher W. J. Smith, Nature reviews: 2005 „Splicing in action: assessing disease causing sequence changes”, D. Baralle, M. Baralle, JMG Online, 2005 „Function of alternative splicing”, Stefan Stamm et al.., Science Direct, 2005 „Mechanisms of alternative pre-messenger RNA splicing”, Douglas L. Black, Annual Review of Biochemistry, 2003

17 BIAŁKA ‘KOMBINOWANE’ (IZOFORMY) GENEROWANIE ZŁOŻONYCH PROTEOMÓW
SEKWENCJA ORF „CELLULAR CODE” ALTERNATYWNY SPLICING ELASTYCZNE i SELEKTYWNE ‘ŁĄCZENIE’ SEKWENCJI TKANKOWO SPECYFICZNA REGULACJA EKSPRESJI INNE MODYFIKACJE ZMIANY O CHARAKTERZE REGULACYJNYM REGULACJA EKSPRESJI NONSENSE-MEDIATED DECAY RUST

18 5’ 3’ Pre-mRNA miejsce donorowe 5’-GU-3’ miejsce rozgałęzienia 5’-A-3’
intron 5’ 3’ ekson 1 ekson 2 miejsce donorowe ’-GU-3’ miejsce rozgałęzienia 5’-A-3’ trakt pirymidyn ’-YYYYYY-3’ miejsce akceptorowe 5’-AG-3’

19 mRNA 2 ekson 1 ekson 3 Intron 1 Intron 2 5’ 3’ ekson 1 ekson 2 ekson 3 mRNA 1 ekson 1 ekson 2 ekson 3 Negatywny czynnik splicingowy (represor splicingu) np. Sxl, PTB Pozytywny czynnik splicingowy (aktywator splicingu) np. białka SR snRNP spliceosomu np. U1 snRNP