Biofizyka makrocząsteczek c.d.

Prezentacja na temat: "Biofizyka makrocząsteczek c.d."— Zapis prezentacji:

1 Biofizyka makrocząsteczek c.d.
Peptydy i białka Biofizyka makrocząsteczek c.d.

2 Mapa konformacyjna wg. Ramachandrana (1963)
Legenda: Regin dozwolony Prawoskrętny helix Antyrównoległa struktura  Równoległa struktura  Potrójny helix kolagenu Lewoskrętny helix Wartości N Równoległa i antyrównoległa struktura  Pierścień zawierający 5 aminokwasów Lewo-skrętny   - helix Podwójna taśma Prawoskrętny  - helix Podwójna taśma Zamknięty pierścień

3 Mapa konformacyjna wg. Ramachandrana c.d.
Obszary „całkowicie dopuszczalne” – 7,5% Obszary „częściowo dopuszczalne” - 22,5% Mapy konformacyjne Ramachandrana umożliwiają wyjaśnienie struktur białek, nie będąc jednak pomocnymi przy ich przewidywaniu

4 Metody stosowane obecnie przy ustalaniu konformacji polipeptydów
rentgenografia

5 Metody stosowane obecnie przy ustalaniu konformacji polipeptydów
rentgenografia spektroskopia w podczerwieni

6 Metody stosowane obecnie przy ustalaniu konformacji polipeptydów
rentgenografia spektroskopia w podczerwieni pomiary aktywności optycznej

7 Metody stosowane obecnie przy ustalaniu konformacji polipeptydów
rentgenografia spektroskopia w podczerwieni pomiary aktywności optycznej pomiary efektu hiperchromowego

8 Metody stosowane obecnie przy ustalaniu konformacji polipeptydów
pomiary wymiany izotopowej, lepkości, rozpro-szenia światła, momentów dipolowych i in. rentgenografia spektroskopia w podczerwieni pomiary aktywności optycznej pomiary efektu hiperchromowego

9 Założenia pomocne przy ustalaniu przewidywanej konformacji polipeptydów
Struktura -helix powstaje przy długich łańcuchach peptydowych

10 Założenia pomocne przy ustalaniu przewidywanej konformacji polipeptydów
Struktura -helix powstaje przy długich łańcuchach peptydowych Struktura  jest charakterystyczna dla krótkich peptydów

11 Założenia pomocne przy ustalaniu przewidywanej konformacji polipeptydów
Struktura -helix powstaje przy długich łańcuchach peptydowych Struktura  jest charakterystyczna dla krótkich peptydów Prolina i hydroksyprolina mają tylko jeden kąt rotacji

12 Założenia pomocne przy ustalaniu przewidywanej konformacji polipeptydów
Struktura -helix powstaje przy długich łańcuchach peptydowych Struktura  jest charakterystyczna dla krótkich peptydów Struktury helikalne powstają z udziałem aminokwasów o krótkich podstwnikach Prolina i hydroksyprolina mają tylko jeden kąt rotacji

13 Założenia pomocne przy ustalaniu przewidywanej konformacji polipeptydów
Struktura -helix powstaje przy długich łańcuchach peptydowych Struktura  jest charakterystyczna dla krótkich peptydów Obecność przy węglu  atomów O lub S uniemożliwia powstawanie heliksów Struktury helikalne powstają z udziałem aminokwasów o krótkich podstwnikach Prolina i hydroksyprolina mają tylko jeden kąt rotacji

14 Podział aminokwasów ze względu na skłonność do tworzenia określonych konformacji łańcuchów peptydowych Aminokwasy tworzące -heliksy: Ala, Glu, Leu, Lys, Met, Tyr Aminokwasy obojętne: Gly Aminokwasy nie tworzące heliksów: - z przyczyn sterycznych: Val, Ileu - z innych przyczyn: Ser, Thr, Pro, Hypro i in.

15 PRZEWIDYWANA OBSERWOWANA Zgodność przewidywanej konformacji polipeptydów z konformacją rzeczywistą Struktura -  Struktura -  Struktura -  Struktura - 

16 Konformacje białek

17 Przewidywanie konformacji białka sprowadza się do określenia obszarów uporządkowanych i nieuporządkowanych, a następnie takiego wyboru wzajemnych ich położeń, aby dawały minimalną energię cząsteczki

18 Jedną z podstawowych metod badania struktury białek jest analiza statystyczna, w której punkt odniesienia stanowi sekwencja aminokwasów w łańcuchach peptydowych o znanej konformacji

19 Podział białek ze względu na ich strukturę przestrzenną
Fibrylarne,

20 Podział białek ze względu na ich strukturę przestrzenną
Fibrylarne, Globularne

21 Funkcje biologiczne białek fibrylarnych
Strukturalne, Ochraniające (w błonach komórkowych), Enzymatyczne (kurczliwe białka mięśni)

22 Podstawowe konformacje występujące w białkach fibrylarnych
 - heliks, Struktura - , Struktura - -cross, Struktura kolagenu

23 Konformacja  - heliks w białkach fibrylarnych,
Występuje we wszystkich białkach typu -keratyn (tj białkach wełny, włosów, rogów, kopyt, paznokci, pazurów, piór)

24 Konformacja  - heliks w białkach fibrylarnych,
Występuje we wszystkich białkach typu -keratyn (tj białkach wełny, włosów, rogów, kopyt, paznokci, pazurów, piór) Organizacja Protofibryle (3 prawoskrętne heliksy zwinięte w lewoskrętne zwoje)

25 Konformacja  - heliks w białkach fibrylarnych,
Występuje we wszystkich białkach typu -keratyn (tj białkach wełny, włosów, rogów, kopyt, paznokci, pazurów, piór) Organizacja Protofibryle (3 prawoskrętne heliksy zwinięte w lewoskrętne zwoje) Mikrofibryle (produkty agregacji protofibryli o średnicy 8 nm)

26 Konformacja  - heliks w białkach fibrylarnych,
Występuje we wszystkich białkach typu -keratyn (tj białkach wełny, włosów, rogów, kopyt, paznokci, pazurów, piór) Organizacja Protofibryle (3 prawoskrętne heliksy zwinięte w lewoskrętne zwoje) Mikrofibryle (produkty agregacji protofibryli o średnicy 8 nm) Makrofibryle (nieregularne włókna o średnicy 10 nm)

27 Struktura filamentów białek typu keratyny

28 Konformacja -  w białkach fibrylarnych,
Występuje w -keratynie i fibroinie jedwabiu

29 Konformacja -  w białkach fibrylarnych,
Występuje w -keratynie i fibroinie jedwabiu W białku wytwarzanym przez muchę Chrysopa flava występuje struktura -cross

30 Konformacja -  w białkach fibrylarnych,
Występuje w -keratynie i fibroinie jedwabiu W białku wytwarzanym przez muchę Chrysopa flava występuje struktura -cross Tworzy płaskie wielowarstwowe układy

31 Konformacja -  w białkach fibrylarnych,
Występuje w -keratynie i fibroinie jedwabiu W białku wytwarzanym przez muchę Chrysopa flava występuje struktura -cross Tworzy płaskie wielowarstwowe układy Zbudowane są przede wszystkim z seryny, glicyny i alaniny występujących w sekwencji Ser-Gly-Ala-Gly

32 Konforma-cja -  w fibroinie jedwabiu
Rozmiar reszty Rozmiar reszty

33 Konformacja kolagenu Organizacja
Potrójny prawoskrętny heliks o masie 300 kDa, średnicy 1,5 nm i długości 280 nm

34 Włókna kolagenowe o średnicy 500 nm
Konformacja kolagenu Organizacja Potrójny prawoskrętny heliks o masie 300 kDa, średnicy 1,5 nm i długości 280 nm Agregacja Włókna kolagenowe o średnicy 500 nm

35 Konformacja kolagenu c.d.

36 Funkcje biologiczne białek globularnych
Enzymatyczne, Regulacja przepuszczalności błon komórkowych, Udział w mechanizmach odporności, Udział w krzepnięcie krwi, Udział w przenoszenie energii itp.

37 Podstawową cechą białek globularnych jest ich różnorodność
Pomimo pewnych prawidłowości – każde z białek fibrylarnych o ustalonej dotychczas strukturze, charakteryzuje się nieco inną konformacją przestrzenna

38 Różnorodność konformacji białek globularnych
Miohemoerytryna Prealbumina Kinaza pirogronianowa, domena 1 Białko obronne tytoniu Immunoglobulina, domena V2 Heksokinaza, domena 2 (a) Dominuje -helix (b) Dominuje struktura -  (b) Konformacje mieszane

39 Wspólne cechy struktur białek globularnych
Występują w postaci oddzielonych od siebie w przybliżeniu kulistych cząsteczek

40 Wspólne cechy struktur białek globularnych
Występują w postaci oddzielonych od siebie w przybliżeniu kulistych cząsteczek Najczęściej występujące konformacje helikalne to -helix, mający jednak tendencje do odkształceń od formy typowej, np. w lizozymie czy karboksypeptydazie

41 Wspólne cechy struktur białek globularnych
Występują w postaci oddzielonych od siebie w przybliżeniu kulistych cząsteczek Łańcuchy polipeptydowe zawierają fragmenty uporządkowane w postaci -helix lub struktury- oraz nieuporządkowane – przyjmujące postać kłębka statystycznego Najczęściej występujące konformacje helikalne to -helix, mający jednak tendencje do odkształceń od formy typowej, np. w lizozymie czy karboksypeptydazie

42 Wspólne cechy struktur białek globularnych
Występują w postaci oddzielonych od siebie w przybliżeniu kulistych cząsteczek Łańcuchy polipeptydowe zawierają fragmenty uporządkowane w postaci -helix lub struktury- oraz nieuporządkowane – przyjmujące postać kłębka statystycznego Najczęściej występujące konformacje helikalne to -helix, mający jednak tendencje do odkształceń od formy typowej, np. w lizozymie czy karboksypeptydazie Typową strukturą- zdaje się być forma antyrównoległa, stwierdzona m.in. w lizozymie, rybonukleazie, papainie i dehydrogenazie mleczanowej

43 Białka globularne wykazują organizację przestrzenną cząsteczek na poziomie struktury trzecio- i czwartorzędowej

44 Pierwsze białka globularne o ustalonej strukturze trzeciorzędowej
Mioglobina (1964)

45 Pierwsze białka globularne o ustalonej strukturze trzeciorzędowej
Mioglobina (1964) Lizozym (1965)

46 Konformacja cząsteczki mioglobiny (wg R.E. Dickerson 1964)
Aminokwas C-końcowy Aminokwas N-końcowy

47 Strukturę trzeciorzędową białek określa się tylko w oparciu o wyniki badań rentgenograficznych

48 Oddziaływania determinujące strukturę trzeciorzędową
elektrostatyczne

49 Oddziaływania determinujące strukturę trzeciorzędową
elektrostatyczne wodorowe

50 Oddziaływania determinujące strukturę trzeciorzędową
elektrostatyczne wodorowe kowalencyjne (mostki S-S)

51 Oddziaływania determinujące strukturę trzeciorzędową
elektrostatyczne wodorowe kowalencyjne (mostki S-S) HYDROFOBOWE

52 Przykład rozmieszczenia fragmentów hydrofilowych (kolor czerwony) i hydrofobowych (kolor niebieski) w cząsteczce białka

53 Implikacje oddziaływań hydrofobowych w cząsteczkach białek
Stosunek aminokwasów polarnych do niepolarnych waha się od 1,09 do 2,99 (średnio ok. 1,45)

54 Implikacje oddziaływań hydrofobowych w cząsteczkach białek
Stosunek aminokwasów polarnych do niepolarnych waha się od 1,09 do 2,99 (średnio ok. 1,45) Białka o niższym stosunku mają tendencje do agregacji, co powoduje zmniejszenie obszarów hydrofobowych na powierzchni kontaktu z wodą

55 Struktura trzeciorzędowa w białkach enzymatycznych
Zmiany konformacji cząsteczki lizozymu podczas procesu katalizy: zwężenie centralnie rozmieszczonej szczeliny na skutek przyłączenia substratu, zmiana konformacji substratu – kwasu N-acetylomuraminowego z krzesełkowej do napiętej konformacji półkrzesełkowej

56 Przykłady współczesnych modeli cząsteczek białek globularnych
(a) Arginaza (b) Peroksydaza askorbinianowa grochu (c) Dekarboksylaza S-adenozylometioniny

57 Struktura czwartorzędowa
Opis wzajemnego położenia i oddziaływania podjednostek białkowych zorganizowanych w większe cząstki

58 Struktura czwartorzędowa
Opis wzajemnego położenia i oddziaływania podjednostek białkowych zorganizowanych w większe cząstki Białka o strukturze czwartorzędowej zawierają z reguły 2, 4, 6 lub 8 takich samych bądź różnych podjednostek

59 Struktura czwartorzędowa
Opis wzajemnego położenia i oddziaływania podjednostek białkowych zorganizowanych w większe cząstki Oligomery białek o strukturze czwartorzędowej mają zdolność do odwracalnej dysocjacji na podjednostki, których aktywność zanika lub pozostaje zmieniona Białka o strukturze czwartorzędowej zawierają z reguły 2, 4, 6 lub 8 takich samych bądź różnych podjednostek

60 Struktura czwartorzędowa
Opis wzajemnego położenia i oddziaływania podjednostek białkowych zorganizowanych w większe cząstki Oligomery białek o strukturze czwartorzędowej mają zdolność do odwracalnej dysocjacji na podjednostki, których aktywność zanika lub pozostaje zmieniona Do asocjacji podjednostek dochodzi dzięki obecności komplementarnych powierzchni kontaktowych, tworzonych głównie przez reszty aminokwasowe o charakterze hydrofobowym Białka o strukturze czwartorzędowej zawierają z reguły 2, 4, 6 lub 8 takich samych bądź różnych podjednostek.

61 Struktura czwartorzędowa
Opis wzajemnego położenia i oddziaływania podjednostek białkowych zorganizowanych w większe cząstki Oligomery białek o strukturze czwartorzędowej mają zdolność do odwracalnej dysocjacji na podjednostki, których aktywność zanika lub pozostaje zmieniona Do asocjacji podjednostek dochodzi dzięki obecności komplementarnych powierzchni kontaktowych, tworzonych głównie przez reszty aminokwasowe o charakterze hydrofobowym Białka oligomeryczne wykazują właściwości kooperatywne wynikające z wzajemnych oddziaływań między jednostkami Białka o strukturze czwartorzędowej zawierają z reguły 2, 4, 6 lub 8 takich samych bądź różnych podjednostek.

62 Porównanie cząsteczki mioglobiny (białko monomeryczne) i hemoglobiny (białko oligomeryczne)
Koniec-N Koniec-C Koniec-C Koniec-N Mioglobina Hemoglobina

63 Przykłady współczesnych modeli cząsteczek białek oligomerycznych
(a) Cheperonina GroEL-GroS (b) Immunoglogulina G

64 Charakterystyka hemoglobiny
Kształt elipsoidalny o wymiarach 6,4 x 5,5 x 5,0 nm i masie 65 kDa

65 Charakterystyka hemoglobiny
Kształt elipsoidalny o wymiarach 6,4 x 5,5 x 5,0 nm i masie 65 kDa Cząsteczka zbudowana z dwóch łańcuchów  i dwóch  A2 A2

66 Charakterystyka hemoglobiny
Kształt elipsoidalny o wymiarach 6,4 x 5,5 x 5,0 nm i masie 65 kDa Cztery łańcuchy peptydowe rozłożone wokół dwukrotnej osi symetrii cząsteczki =144 reszty aminokwasowe =146 reszt aminokwasowych Cząsteczka zbudowana z dwóch łańcuchów  i dwóch  A2 A2

67 Charakterystyka hemoglobiny
Kształt elipsoidalny o wymiarach 6,4 x 5,5 x 5,0 nm i masie 65 kDa Struktura trzeciorzędowa pojedynczych łańcuchów zbliżona jest do mioglobiny Cztery łańcuchy peptydowe rozłożone wokół dwukrotnej osi symetrii cząsteczki =144 reszty aminokwasowe =146 reszt aminokwasowych Cząsteczka zbudowana z dwóch łańcuchów  i dwóch  A2 A2

68 Charakterystyka hemoglobiny
Kształt elipsoidalny o wymiarach 6,4 x 5,5 x 5,0 nm i masie 65 kDa Struktura trzeciorzędowa pojedynczych łańcuchów zbliżona jest do mioglobiny Cztery łańcuchy peptydowe rozłożone wokół dwukrotnej osi symetrii cząsteczki =144 reszty aminokwasowe =146 reszt aminokwasowych Cząsteczka zbudowana z dwóch łańcuchów  i dwóch  A2 A2 Łańcuchy  i  otaczają wolną przestrzeń wzdłuż osi cząsteczki (tzw. Jama wewnętrzna lub centralna) o długości 5 nm, zawierającą polarne reszty aminokwasowe i wypełnioną wodą

69 Budowa hemoglobiny Koniec-N Koniec-C

70 Oddziaływania w cząsteczce
Przeważnie niepolarne (hydrofobowe), Nieliczne mostki siarczkowe i wiązania jonowe (mostki solne). Brak wiązań kowalencyjnych

71 Oddziaływania w cząsteczce
Przeważnie niepolarne (hydrofobowe), Nieliczne mostki siarczkowe i wiązania jonowe (mostki solne). Brak wiązań kowalencyjnych Poszczególne oddziaływania w cząsteczce różnią się trwałością i dlatego w warunkach fizjologicznych hemoglobina występuje w równowadze między tetramerem i dimerem.

72 Oddziaływania w cząsteczce
Przeważnie niepolarne (hydrofobowe), Nieliczne mostki siarczkowe i wiązania jonowe (mostki solne). Brak wiązań kowalencyjnych Poszczególne oddziaływania w cząsteczce różnią się trwałością i dlatego w warunkach fizjologicznych hemoglobina występuje w równowadze między tetramerem i dimerem. Wraz ze wzrostem stężenia soli zwiększa się stopień dysocjacji hemoglobiny na dimery i monomery

73 Rodzaje kontaktów między podjednostkami
Kontakty podjednostek niejednakowych (łańcuchy różnoimienne są wzajemnie komplementarne i ściśle do siebie przylegają): - 12 = 21 – kontakty podjednostek z blisko położonymi hemami, utworzone z ok. 80 atomów (19 reszt aminokwasowych), - 11 = 22 – kontakty podjednostek z odległymi hemami, utworzone z ok. 110 atomów (34 reszty aminokwasowe) – kontakty rozleglejsze i bardziej ścisłe Kontakty podjednostek jednakowych 1 2 = 1 2 – kontakty o charakterze polarnym (mostki solne) występujące tylko w deoksyhemoglobinie (hemoglobinie odtlenowanej)

74 Mostki solne stabilizujące strukturę deoksyhemoglobiny
1 2 3 4 C-końcowa Arg N-końcowa Val Asp 126 Asp 94 C-końcowa His Lys 82 His 143 Lys 40 Lys 86 2:3 DPG Tetramer hemoglobiny utrzymywany jest przez 8 mostków solnych

75 Efekt allosteryczny Zmiany konformacji cząsteczki białkowej w skutek przyłączenia ligandów (niskocząsteczkowych związków lub jonów o charakterze substratów, aktywatorów lub inhibitorów) Efekt allosteryczny wiąże się z: Katalizą enzymatyczną, Przepuszczalnością błon komórkowych, Przenoszeniem tlenu przez hemoglobinę Przenoszeniem energii, bodźców nerwowych i in.

76 Modele funkcjonowania białek allosterycznych
Model Monda, Wymana i Changeux 1965 (M-W-C), Model Koshlanda, Nemethy i Filmera 1966

77 Założenia modelu M-W-C
Białka allosteryczne są oligo- bądź polimerami złożonymi z kilku identycznych podjednostek zajmujących równoważne pozycje. Cała cząsteczka jest więc symetryczna, Każda jednostka ma 1 pozycję wiążącą, co powoduje tożsamość symetrii wszystkich stereospecyficznych receptorów i całej cząsteczki, Między identycznymi pozycjami aktywnymi w cząsteczce, wiążącymi takie same ligandy występują oddziaływania (efekty) homotropowe, Między różnymi pozycjami aktywnymi wiążącymi inne ligandy następują efekty heterotropowe, Białko może istnieć w co najmniej dwóch różnych stanach konformacyjnych, różniących się powinowactwem do ligandu,

78 Założenia modelu M-W-C c.d.
Przejścia konformacyjne od jednego stanu do drugiego są odwracalne, Podczas allosterycznego przejścia symetria cząsteczki nie zmienia się, a zatem zmiana konformacji podjednostek następuje jednocześnie, a stany przejściowe można uznać za nietrwałe. Gdzie: R – stan rozluźniony, T – stan anpięty, L –stała równowagi R T L = [T]/[R] L – stała allosteryczna, której wartość wskazuje na prawdopodobieństwo występowania białka w określonym stanie konformacyjnym

79 Założenia modelu Koshlanda i in.
Przyłączenie ligandu przez białko oligomeryczne przebiega przez kolejno następujące po sobie zmiany konformacyjne podjednostek, przyczym: - zmiana konformacji jednego protomeru nie jest przekazywana na sąsiednie podjednostki, - podjednostki są sztywno związane i jedna z nich – wiążąca ligand – oddziaływuje na sąsiednie powodując wzrost bądź spadek ich powinowactwa do ligandu, co umożliwia występowanie różnych stanów pośrednich kolejno następujących po sobie przemian konformacyjnych.

80 Założenia modelu Koshlanda i in. c.d.
L[A] = [B] A B B + X BX K[B] = [BX] gdzie: A, B – stany konformacyjne białka, X – ligand, K – stała równowagi reakcji każdej podjednostki z ligandem (określa powinowactwo jednostki do ligandu), L – stała równowagi charakteryzująca reakcję przemiany konformacyjnej podjednostki

81 Zmiany struktury hemoglobiny sprzężone z wiązaniem tlenu (oksygenacją)

82 Zmiany odległości między atomami Fe
2 3,34 1 2 3,99 1 2,50 2,50 2,47 2,47 3,50 3,69 1 3,60 2 1 3,49 2 (a) Oksyhemoglobina (b) Deoksyhemoglobina

83 Geometria wiązania Fe w cząsteczce hemoglobiny

84 Modyfikacja kontaktów między niejednakowymi podjednostkami
11 = 22 przesunięcie atomów rzędu 0,1 nm, 12 = 21 przesunięcie atomów rzędu 0,7 nm,

85 Zmiana struktury czwartorzędowej hemoglobiny na skutek oksygenacji

86 Łączenie się hemoglobiny z tlenem
Podstawowa funkcja hemoglobiny wiąże się ze zdolnością odwracalnego łączenia się z tlenem za pośrednictwem Fe bez zmiany jego wartościowości Reakcja łączenia się hemoglobiny z tlenem nie podlega prostemu prawu oddziaływania mas ze względu na obecność w cząsteczce 4 pozycji wiążących tlen (kooperatywne wiązanie tlenu)

87 Oksygenacja mioglobiny
połączenie za pośrednictwem 1 pozycji zgodne z prawem oddziaływania mas: Mb + O2 MbO2 Stała równowagi reakcji K = [MbO2]/[Mb][O] lub K = Y/(1-Y)pO2 Funkcja nasycenia mioglobiny tlenem Y = MbO2/([MbO2] + [Mb]) lub Y = KpO2/(1 + Kp KpO2) po zastąpieniu stężenia tlenu jego ciśnieniem parcjalnym

88 Oksygenacja hemoglobiny
połączenie za pośrednictwem 4 pozycji niezgodne z prawem oddziaływania mas: Hb4 + O2 Hb4 (O2) Hb4 (O2) + O2 Hb4 (O2)2 Hb4 (O2)2 + O2 Hb4 (O2)3 Hb4 (O2)3 + O2 Hb4 (O2)3 Reakcji towarzyszą 4 różne stałe K (tzw stałe asocjacji lub stałe Adaira)

89 Oksygenacja hemoglobiny
Funkcja nasycenia hemoglobiny tlenem (K1p + 2K1pK2p2 + 3K1pK2p2K3p3 + 4K1pK2p2K3p3K4p4) YO2 = 4(1 + K1p + K1 + K2p2 + K1K2K3p3 + K1K2K3K4p4

90 Równanie opisujące krzywą wiązania tlenu przez hemoglobinę (Hill, 1910)
Y/(1-Y) = K(pO2)n

91 Krzywe dysocjacji telnowej hemoglobiny (A) i mioglobiny (b)
100 A Nasycenie hemoglobiny tlenem (%) B 5,3 x 103 13,3 x 103 Ciśnienie tlenu w Pa