Pobieranie prezentacji. Proszę czekać

Pobieranie prezentacji. Proszę czekać

Zastosowanie kalorymetrii ITC w badaniach białek Katarzyna Breer.

Podobne prezentacje


Prezentacja na temat: "Zastosowanie kalorymetrii ITC w badaniach białek Katarzyna Breer."— Zapis prezentacji:

1 Zastosowanie kalorymetrii ITC w badaniach białek Katarzyna Breer

2 Kalorymetria, czyli,,mierzenie ciepła’’ DSC (differential scanning calorimetry) ITC (isothermal titration calorimetry)

3 T – const, p – const 81  M domena SH2 Lck ligand 0.4mM fosfopeptyd TEGOqYQPQPA Current Opinion in Structural Biology Leavitt and Freire 2001

4 Warianty metody Enzym/substrat/inhibitor Single injection Dysocjacja (dimeru)

5 Kalorymetr ITC VP-ITC Objętość celki ~1.4 ml Objętość strzykawki ~ 270  l Peltier C Szum 0.5 ncal/s

6 Jakie informacje można uzyskać z krzywej miareczkowania ITC? QL=HLQL=HL  Q ML =  H ML  H cal Miareczkowanie ~8  M PNP (cielęce) Guaniną 20 mM Hepes pH 7.0, 25 0 C

7 Identyczne, nieoddziałujące miejsca wiązania  – frakcja miejsc zajętych  – frakcja miejsc wolnych [L] t  [L] + n  M] t  Q  n  M] t ·V 0  H ML

8 Parametr sigmoidalności C = K a [M] t 10 < C < 1000 Wiseman et al K a ~10 8 – 10 9 M -1

9 Leavitt and Freire 2001 KAKA ~K B Proteaza HIV-1

10 Wiązanie kompetycyjne Słaby inhibitorSilny inhibitor  Q(i) = V 0 [M] t (  H A  A (i) +  H B  B (i)) Sigurskjold 2000

11 dG (T,p,N) = –SdT + Vdp +  i dN i Parametry termodynamiczne U(S,V,N) = TS – pV +  N dU (S,V,N) = TdS – pdV +  i dN i Naturalne zmienne ITC to (T,p,N) G (T,p,N) = U – TS + pV =  i N i dG  0 Proces spontaniczny Energia chemiczna

12 G = U + pV – TS = H – TS Związek entalpii, entropii i energii swobodnej Gibbsa Wiązania wodorowe Oddziaływania van der Waalsa Oddziaływania elektrostatyczne Solwatacja Wewnętrzne stopnie swobody dG = dH – TdS Wkład entalpowy (cieplny) Wkład entropowy

13  G = -RTln K a N = 0.6 K a = (4.9  0.4) 10 6 M -1  H cal =  0.1 kcal/mol  S = -5.0 kcal/mol ~8  M PNP 25 0 C, 20 mM Hepes pH 7.0 N = 0.5  0.1 K a = (11.3  0.9) 10 6 M -1 ~0.2  M PNP

14 [M] t = 0.92  M [M] akt = 0.96  M K a = (5.3  2.5) 10 9 M -1

15 Niezależnie wiążące miejsca Zachowania nieszablonowe Miejsca oddziałujące – kooperacja [L] t  [L] +  M] t (n 1  1  H 1 +n 2  2  H 2 ) Q  t V 0 (n 1    H 1 + n 2    H 2 )

16

17 Miareczkowania PNP ligandem DFPP-DG 20 mM Hepes pH 7.0, 20 0 C N = 1.0 K a = (1.2  0.5) 10 9 M -1  H = -5.7  0.04 kcal/mol  S = 6.6 kcal/mol N 1 = 0.8 K 1 = (6.7  6.4 ) M -1  H 1 = -6.3  0.05 kcal/mol  S 1 = 8.2 kcal/mol N 2 = 0.2 K 2 = (3.1  2.8) 10 8 M -1  H 2 = 5.8  0.2 kcal/mol  S 2 = 17.6 kcal/mol

18 Analiza van’t Hoff’a KaKa Izobara van’t Hoff’a Entalpia van’t Hoff’a

19 KaKa Entalpia van’t Hoff’a

20 Polimeraza Klenowa Datta et al., 2006 Forma całkowa izobary van’t Hoff’a

21  C p ~ - (0.9 – 1.2) kcal/(mol K) Napędzana entropowo T H Napędzana entalpowo T S

22 Zależność  H cal (T) dla wiązania DFPP-DG przez PNP  C p – const.  C p =  kcal/(mol K)

23 Zależność K as (T) K as ~ M -1 Poza zakresem pracy metody

24 N = 0.9 K a = (1.4  0.1) 10 7 M -1  H =  0.1 kcal/mol T  S = -2.4 kcal/mol N 1 = 1.0 K 1 = (0.2  1.7) M -1  H 1 = -6.2  0.1 kcal/mol T  S 1 = 7.6 kcal/mol N 2 = 0.1 K 2 = (0.4  3.0) 10 9 M -1  H 2 = 9.6  2.6 kcal/mol  S 2 = 1.7 kcal/mol  ligand Guanina

25 Zmiany entropii i entalpii  S (T)=  S solv (T) +  S conf (T) +  S inne (T)  S solv (T) =  C p ln(T/T S )  H (T) =  H conf (T) +  H intrinsic (T)

26 Luić et al ASA solvent accessible surface area  H =  H conf + a(T)·  ASA ap + b(T) ·  ASA pol  C p ap 0

27 Kompleksy białko – białko Fab E8 cytochrom c oraz przeciwciało E8 Mylvaganam et al., 1998  C p ~ - (0.2 – 0.6) kcal/(mol K)

28  H cal –  H vH = const

29 Miareczkowania proteazy HIV-1 indivinavirem Przepływ protonów Acetate 0.1 kcal/mol MES 3.7 kcal/mol ACES 7.5 kcal/mol  H app =  H bind + n H+  H ion Todd et al., 2000

30 K conf K1K1 K0K0 Równowaga dynamiczna Eftink et al., 1983 log K conf  C p app jedna forma wiąże obie formy wiążą ligand

31 Temperature Kompleksy białko – DNA Dragan et al., 2004

32 Jak projektować inhibitory? 4·10 9 M -1 5·10 10 M -1 9·10 10 M M -1

33 Muzammil et al., 2007 Mutant V82F/I84V 130x 15x 25x 40x

34 MDR mutant 700x 50x 20x 20x

35 Allosteria,,entropowa” Białko CAP

36 Na podstawie widm NMR 2D 1 H- 15 N HSQC BRAK ZMIAN KONFORMACYJNYCH

37  s – ms powolne ruchy domen

38 Podziękowania dla: Romana Szczepanowskiego Matthias’a Bochtler’a

39  S > 0 woda została wypchnięta z powierzchni kompleksu  S < 0 może mieć wiele przyczyn i nie koniecznie znaczyć, że hydratacja wzrosła, bądź się nie zmieniła Energie wiązań: Elektrostatyczne w wodzie ~1A 20kJ/mol Wodorowe 4-25 kJ/mol Hydrofobowe 4 kJ/mol van der Waalsa 0. 5 kJ/mol


Pobierz ppt "Zastosowanie kalorymetrii ITC w badaniach białek Katarzyna Breer."

Podobne prezentacje


Reklamy Google