Pobieranie prezentacji. Proszę czekać

Pobieranie prezentacji. Proszę czekać

Interferencja RNA (RNAi, RNA interference). Nobel 2006 Andrew Fire i Craig C. Mello.

Podobne prezentacje


Prezentacja na temat: "Interferencja RNA (RNAi, RNA interference). Nobel 2006 Andrew Fire i Craig C. Mello."— Zapis prezentacji:

1 Interferencja RNA (RNAi, RNA interference)

2 Nobel 2006 Andrew Fire i Craig C. Mello

3 RNAi historia  1998 – wprowadzenie dsRNA do nicienia C. elegans wycisza ekspresję genu o sekwencji komplementarnej → interferencja RNA (Craig, Mello)  pierwsze wskazówki jednak już w latach 1990: próba wprowadzenia dodatkowego genu syntazy chalonowej daje efekt odwrotny – poziom mRNA dla syntazy spada Konserwatywny mechanizm w świecie zwierząt i roślin spełniający funkcje: 1.Obrona przed infekcjami wirusowymi 2.Obrona przed transpozonami 3.Regulacja metylacji DNA w obrębie promotora Matzke MA, Matzke AJM (2004) Planting the Seeds of a New Paradigm. PLoS Biol 2(5): e133

4 Wprowadzenie do tytoniu dwóch osobnych transgenów wykorzystujących taki sam promotor promotorGen 1 promotorGen 2 x  Wyciszenie i metylacja zanikają w kolejnych komórkach potomnych na skutek odseparowania dwóch transgenów  Interakcja wspólnych promotorów indukuje transkrypcyjne wyciszanie ekspresji genów -TGS (transcriptional gene silencing) Pierwszy transgen jest aktywny o ile nie jest w komórce obecny drugi transgen → metylacja DNA promotora wyciszanego transgenu w obecności drugiego zawierającego sekw. homologiczne CH 3

5 siRNA (ang. short interfering RNA) – krótka dwuniciowa cząsteczka RNA (21-23 nt) o sekwencji homologicznej do fragmentu docelowego mRNA

6 końce 3’ mają 2nt niesparowane DICER Uwaga: wprowadzanie dsRNA do komórek kręgowców indukuje odpowiedź interferonową

7 DICER – enzym typu RNAza III Zawiera domeny:  Domena o właściwościach helikazy i hydrolazy fosfodwuestrowej;  RBD (RNA Binding domain) – wiążąca RNA  dsRBD (dsRNA Binding domain) – wiążąca dsRNA  PAZ (Piwi, Argonaute, Zwille/Pinhead); działa w postaci dimerycznej → produkty działania enzymu DICER mają niesparowane 2 nukleotydy na końcu 3’ i grupę fosforanową na końcu 5’ (inne produkty słabiej indukują interferencję)

8 RISC (RNA-induced silencing complex) jest złożony: 1. Białka z rodziny Argonaute posiadają 3 domeny:  PAZ – wiązanie końca 3’ siRNA  Mid - wiązanie końca 5’ siRNA  PIWI – aktywność endonukleazy (pokrewna RNAzy H) Ago1 – odpowiedzialny za represję, Ago2 – za właściwości endonukleazy do kompleksu RISC wchodzą jeszcze inne białka o nieznanej dotąd funkcji (VIG, Tudor- SN, Fragile-X, Dmp68, Gemin3) RISC jest częścią struktury cytoplazmatycznej zwanej ciałkami P (P- bodies)

9 Degradacja mRNA przez kompleks RISC: 1.w kompleksie RISC dochodzi do degradacji nici sensownej, pozostaje antysensowna (wiodąca); wybór nici jest uzależniony od stabilności termodynamicznej końców siRNA – nić posiadająca mniejszą stabilność na końcu 5’ pozostaje w RISC (etap katalizowany przez DICER) 2.w rejonie „seed” zlokalizowanym pomiędzy 2 i 8 nukleotydem od końca 5’ następuje rozpoznanie i wiązanie z docelowym mRNA 3.antysensowna nić hybrydyzuje z komplementarnym mRNA tworząc krótki fragment dwuniciowy 4.przecięcie mRNA w pojedynczym miejscu oddalonym pomiędzy 11-12nt od końca 3’ siRNA (Ago2) 5.dalsza degradacja mRNA przez niespecyficzne egzonukleazy siRNA mRNA

10  w przypadku niepełnej komplementarności sekwencji siRNA do mRNA zachodzi inhibicja translacji Mechanizmy odpowiedzialne za ogólną degradację mRNA: 1.przed degradacją zachodzi proces deadenylacji końca 3’ poli(A), po której następuje działanie egzonukleolityczne 3’ – 5’ przez egzosom 2.dekapowanie przez Dcp1/Dcp2, po którym degradacja przy udziale egzonukleaz 5’ - 3’

11 Gregory J. Hannon RNA interference, Nature (2002) 418, Zjawisko przechodzącego wyciszania (transitive silencing) białko fuzyjne UNC-22 i GFP przejście wyciszenia w kierunku od 3’ do 5’ GFP siRNA wyciszenie UNC-22 i GFPwyciszenie GFP

12 pierwotne siRNA wtórne siRNA Brodersen and Voinnet The diversity of RNA silencing pathways in plants TRENDS in Genetics (2006) 22, polimeraza RNA zależna od RNA RdRP (RNA-dependent RNA polymerase) dsRNA Mechanizm przechodzącego wyciszania

13 Metody wytwarzania siRNA: 1.synteza chemiczna (siRNA) 2.transkrypcja in vitro (esiRNA) 3.wektory ekspresyjne siRNA (shRNA jako pośredni etap) 4.ekspresyjne kasety PCR Kryteria projektowania cząsteczek siRNA: 1.Znajdź sekwencję 21nt która zaczyna się od AA (siRNA posiadające jednoniciowe odcinki UU działają najefektywniej); jeśli się nie da – należy wybrać sekwencję NA lub inną ale unikać jednoniciowych odcinków GG w siRNA 2.Zaprojektuj 2-4 sekwencje w różnych rejonach ale nt poniżej AUG (w obrębie 5’ UTR lub 3’ UTR mRNA może być związane z białkami oraz posiadać złożoną strukturę) – jedna na dwie daje 50% hamowanie a jedna na cztery – 75-95% 3.zawartość GC – 30-70% (optymalnie 50%) 4.unikać ciągu (G) 3 gdyż mogą się tworzyć agregaty cząsteczek siRNA 5.koniec 5’ nici antysensownej ma mieć mniejszą stabliność termodynamiczną 6.Sprawdź komplementarność do innych genów


Pobierz ppt "Interferencja RNA (RNAi, RNA interference). Nobel 2006 Andrew Fire i Craig C. Mello."

Podobne prezentacje


Reklamy Google