Pobieranie prezentacji. Proszę czekać

Pobieranie prezentacji. Proszę czekać

GEN ROZSZERZENIE DEFINICJI NA WSZYSTKIE TRANSKRYBOWANE SKEWNECJE DNA.

Podobne prezentacje


Prezentacja na temat: "GEN ROZSZERZENIE DEFINICJI NA WSZYSTKIE TRANSKRYBOWANE SKEWNECJE DNA."— Zapis prezentacji:

1 GEN ROZSZERZENIE DEFINICJI NA WSZYSTKIE TRANSKRYBOWANE SKEWNECJE DNA

2 POWSZECHNIE POD POJĘCIEM GENU ROZUMIE SIĘ SEKWENCJĘ DNA, SŁUŻĄCĄ JAKO INFORMACJA GENETYCZNA, TRANSKRYBOWANA DO KODUJĄCYCH BIAŁKO CZĄSTECZEK RNA ncRNAs

3 Typy RNA KODUJĄCE W translacji (mRNA) NIEKODUJĄCE Regulatorowe RNA W translacji (tRNA, rRNA) W obróbce RNA Genomy RNA W odwrotnej transkrypcji Dwuniciowe RNA

4 Endogenne siRNA (short interfering RNA) Endogenne siRNA (short interfering RNA) miRNA (micro RNA) miRNA (micro RNA) Niekodujące małe RNA (ncRNA): Niekodujące małe RNA (ncRNA): raRNA (repeat associated RNA) raRNA (repeat associated RNA) piRNA (PIWI-interacting RNA) piRNA (PIWI-interacting RNA) niekodujące RNA

5 Wyciszanie przy pomocy siRNA (SureSilencing siRNA Kits) SuperArray Simplicity

6 Co to jest siRNA SuperArray Simplicity Krótki interferujący RNA, lub w skrócie siRNA (ang. small interfering RNA), to krótkie dupleksy RNA o długości między 15, a 21 nukleotydów. Dupleksy te posiadają w obydwu niciach lepkie końce 3 OH, a końce 5 obydwu nici są fosforylowane. Po wprowadzeniu do komórek (transfekcji) siRNA przy pomocy komórkowej maszynerii atakuje cząsteczki informacyjnego RNA (mRNA) w miejscach, które mają identyczną sekwencję, po czym rozpoczyna się degradacja katalizowana przez odpowiednie enzymy. Degradowany mRNA nie służy już jako matryca dla translacji (biosyntezy białka) i w ten sposób ekspresja genu, z którego powstał ulega wyciszeniu.

7 Interferujący RNA (RNAi) odkryto pierwotnie u nicienia C. elegans. Po wstrzyknięciu długich odcinków dwuniciowego (ds.) RNA do gonady robaka (typowy sposób wprowadzania transgenów do robaków) blokowały one ekspresję edogennych genów zgodnie z ich specyficzną sekwencją. U eukariota większość genów kodujących białka jest transkrybowana przez polimerazę II, która syntezuje cząsteczki pre-mRNA obrabiane następnie do dojrzałych postaci mRNA. Dojrzałe cząsteczki mRNA są transportowane z jądra komórkowego do cytoplazmy, gdzie podlegają translacji.

8 RNAi jest niedawno odkrytym mechanizmem regulacji endogennej ekspresji genów. U roślin regulacja za pośrednictwem RNAi jest uruchamiana przez kodowane w ich genomie krótkie regulatorowe RNA znane jako mikro-RNA. U glonów, robaków i much RNAi mogą być aktywowane przez mechanizm endogennej transpozycji. U roślin (a także w hodowanych komórkach owadzich) RNAi pełnią również rolę w obronie przeciw wirusom. Polega ona na atakowaniu wirusowych cząsteczek dsRNA przez enzymy mechanizmu wykorzystującego RNAi.

9 Gdy cząsteczki długiego dwuniciowego (ds) RNA wnikną do komórki są one rozpoznawane i cięte przez czynnik białkowy o nazwie Dicer, który jest zaliczany rodziny RNAzy III endonukleaz swoistych wobec dsRNA. Cięcie przez Dicer tworzy krótkie dsRNA, które charakteryzują się dwunukleotydowymi wystającymi końcami 3 z grupami –OH. Cząsteczki takie są nazywane krótki/mały interferujący (ang. small interfering) RNA.

10 U robaków, much i ssaków siRNA mogą tworzyć kompleksy rybonukleoproteinowe zwane RISC (ang. RNAi silencing complex). Ten kompleks zawiera nukleazę o charakterze endonukleazy wytwarzającej 5' fosfomonoester RNA, którą nazwano także Slicer (Siekacz).

11 RISC najpierw pośredniczy w rozwijaniu dupleksu siRNA. Jednoniciowy siRNA jest następnie przyłączany do RISC, a następnie łączy się z mRNA na zasadzie komplementarności zasad. To połączenie jest potrzebne do ustawienia mRNA w stosunku do Slicera celem przecięcia nici mRNA (miejsce cięcia znajduje się w środku sekwencji komplementarnej do przyłączonego siRNA).

12 Przecięty mRNA jest rozpoznany przez komórkę jako nieprawidłowy i ulega degradacji. Zapobiega to dalszej translacji, prowadząc do wyciszenia ekspresji genu, którego produktem jest degradowany mRNA.

13 U roślin nieprawidłowy RNA powstający w wyniku rozcinania za pośrednictwem RISC może również służyć jako matryca zależnej od RNA polimerazy RNA (RdRp – ang. RNA dependent RNA polymerase) to syntezy nowych cząsteczek dsRNA. Proces ten polega na nie wymagającej starterów syntezie RNA, w której nieprawidłowy pocięty RNA służy jako matryca.

14 Powstały w ten sposób dsRNA jest ponownie substratem dla Dicera, który wytwarza więcej cząsteczek siRNA. W niektórych organizmach z endogennym mechanizmem RNAi (np.: grzyby, rośliny, robaki i ssaki) RNAi występuje jeszcze inny etap z udziałem RNAi.

15 W etapie tym jednoniciowe siRNA (nie związane z RISC) wiążą się do niszczonych mRNA w miejscach komplementarnych i służą jako startery dla RdRp do syntezy antysensownej nici RNA. Specyficzność tego typu jest wrażliwa na naturalną zmienność sekwencji.

16 Cząsteczka dsRNA, która powstaje w tym procesie służy jako substrat dla Dicera, który rozcina ją na siRNA. Nowopowstałe siRNA mogą się rozdzielać do jednoniciowych i wtedy służą jako startery RdRp lub wraz z RISC pośredniczą w cięciu innych cząsteczek mRNA.

17 Takie namnażanie połączone z rozsiewaniem RNAi między komórki (mechanizm na razie nie znany) jest prawdopodobnie podstawa przekazywania RNAi w liniach komórek rozrodczych u robaków.

18 Komórkowy mechanizm intereferencji RNA. Długi dwuniciowy RNA (dsRNA) jest cięty, przez enzym zwany Dicer, na małe interferujące cząsteczki RNA (siRNA). Te cząsteczki siRNAs są wbudowywane do indukowanego za pomocą RNA kompleksu wyciszającego (ang. RNA-induced silencing complex - RISC), w którym nici są rozdzielane. RISC zawierający nić wiodącą lub antysensową wyszukuje i wiąże się do komplementarnych sekwencji mRNA. Te sekwencje mRNA są następnie cięte przez Argonaute, który jest enzymem w RISC odpowiedzialnym za degradację mRNA, co skutkuje obniżeniem modulacji mRNA. A – adenozyna. Bumcrot, et al. NAT. CHEM. BIOL. 2:712 (2006)

19 Chemiczne modyfikacje siRNAs. Pokazane są struktury cukrów, szkielet i modyfikacje zasad oraz konjugaty cholesterolowe.

20 Krytyczne pozycje nukleotydów w cząsteczkach siRNA. Pokazane są nukleotydy ważne dla potencjalnego rozpoznawania mRNA, cięcia mRNA i swoistości cięcia, w tym minimalizacji niecelowanej degradacji. Bumcrot, et al. NAT. CHEM. BIOL. 2:712 (2006)

21 Wykorzystanie siRNA SuperArray Simplicity W praktyce, zaprojektowanymi odpowiednio cząsteczkami siRNA atakującymi produkt wybranego genu można transfekować komórki, w których ma być zablokowana ekspresja tego genu. Wynik takiego zabiegu można wykrywać różnymi metodami biochemicznymi, molekularnymi i biologii molekularnej, które pozwalają zrozumieć znaczenie tego genu w biologii badanego obiektu. Próby wyciszania genów w schorzeniach o podłożu genetycznym

22 Odkryty u nicienia C.elegans gen lin-4 hamujący gen lin-14 poprzez wiązanie z częścią 3UTR mRNA (1993) Odkryty u nicienia C.elegans gen lin-4 hamujący gen lin-14 poprzez wiązanie z częścią 3UTR mRNA (1993) Kolejny odkryty gen kodujący miRNA to let-7 (2000), znaleziony u C. elegans, D. melanogaster, człowieka Kolejny odkryty gen kodujący miRNA to let-7 (2000), znaleziony u C. elegans, D. melanogaster, człowieka Konserwatywne filogenetycznie, negatywne regulatory ekspresji genów Konserwatywne filogenetycznie, negatywne regulatory ekspresji genów miRNA

23 Liczba poznanych genów miRNA rośnie i waha się w zależności od gatunku od 200 – 1000 (dla człowieka 470) – baza danych miRNA Liczba poznanych genów miRNA rośnie i waha się w zależności od gatunku od 200 – 1000 (dla człowieka 470) – baza danych miRNA Geny kodujące miRNA występują w intronach bądź w obszarach pozagenowych Geny kodujące miRNA występują w intronach bądź w obszarach pozagenowych Występują pojedynczo, bądź w policistronowych skupiskach Występują pojedynczo, bądź w policistronowych skupiskach Ponad połowa genów miRNA człowieka mieści się w miejscach często ulegających amplifikacji, delecji, bądź rearanżacji w transformacji nowotworowej Ponad połowa genów miRNA człowieka mieści się w miejscach często ulegających amplifikacji, delecji, bądź rearanżacji w transformacji nowotworowej Jeden rodzaj miRNA może wpływać na ekspresję wielu genów Jeden rodzaj miRNA może wpływać na ekspresję wielu genów miRNA

24 Transkrypt pri-miRNA (primary miRNA) ma długość kilkaset par zasad i z udziałem białka Drosha następuje wycięcie z niego fragmentu 70 nukleotydowego przypominającego szpilkę do włosów Transkrypt pri-miRNA (primary miRNA) ma długość kilkaset par zasad i z udziałem białka Drosha następuje wycięcie z niego fragmentu 70 nukleotydowego przypominającego szpilkę do włosów Enzym Drosha tworzy kompleks z DGCR8 (DiGeorge syndrome Critical Region 8) u ssaków Enzym Drosha tworzy kompleks z DGCR8 (DiGeorge syndrome Critical Region 8) u ssaków Następnie tak powstały pre-miRNA jest transportowany do cytoplazmy za pomocą białka Exportin-5, zależnego od GTP Następnie tak powstały pre-miRNA jest transportowany do cytoplazmy za pomocą białka Exportin-5, zależnego od GTP Biogeneza miRNA

25 W dalszym etapie dojrzewania bierze udział enzym DICER, zależny od ATP, mający duże powinowactwo do dsRNA. W dalszym etapie dojrzewania bierze udział enzym DICER, zależny od ATP, mający duże powinowactwo do dsRNA. Enzym ten przecina pre-miRNA z jednej strony pętli niesparowanych nukleotydów tworząc przejściową, dwuniciową formę miRNA Enzym ten przecina pre-miRNA z jednej strony pętli niesparowanych nukleotydów tworząc przejściową, dwuniciową formę miRNA Prawidłowe działanie enzymu DICER jest związane z łączeniem się w kompleks z białkiem towarzyszącym TRBP (HIV-1 Transactivating response RNA-binding protein) Prawidłowe działanie enzymu DICER jest związane z łączeniem się w kompleks z białkiem towarzyszącym TRBP (HIV-1 Transactivating response RNA-binding protein) miRNA

26 Łańcuchy dojrzałych miRNA mają długość ok nukleotydów i są nietrwałe Łańcuchy dojrzałych miRNA mają długość ok nukleotydów i są nietrwałe Krótki okres półtrwania dupleksu miRNA wynika najprawdopodobniej z faktu że cząsteczki miRNA są szybko włączane do kompleksu RISC (RNA induced silencing complex), który zawiera m.in. białka rodziny Argonout Krótki okres półtrwania dupleksu miRNA wynika najprawdopodobniej z faktu że cząsteczki miRNA są szybko włączane do kompleksu RISC (RNA induced silencing complex), który zawiera m.in. białka rodziny Argonout miRNA

27

28 1.Jeśli sekwencja miRNA jest wysoce komplementarna do 3 UTR mRNA następuje degradacja transkryptu poprzez najprawdopodobniej rybonukleazę (Slicer) w kompleksie RISC (zachodzi głównie u roślin) 2.Jeśli sekwencja miRNA jest mniej komplementarna wtedy kompleks RISC asocjuje z kompleksem blokującym połączenie się obu jednostek rybosomu i hamuje translację (spotykane głównie w komórkach zwierzęcych za wyjątkiem HOXB 8) Mechanizm działania miRNA

29 Sygnalizacja międzykomórkowa – miR-375 (specyficzny dla trzustki) hamuje wydzielanie insuliny Sygnalizacja międzykomórkowa – miR-375 (specyficzny dla trzustki) hamuje wydzielanie insuliny miRNA bierze udział w rozwoju, kontrolując np. geny HOX, rozwój układu nerwowego czy hematopoezy miRNA bierze udział w rozwoju, kontrolując np. geny HOX, rozwój układu nerwowego czy hematopoezy miRNA wybiórczo występuje w zarodkowych komórkach macierzystych (ES) i może odpowiadać za ich możliwości samoodnowy ale i zdolności do różnicowania (w komórkach ES opisano ekspresję 36 miRNA z czego specyficznych wydaje się 15 z nich) miRNA wybiórczo występuje w zarodkowych komórkach macierzystych (ES) i może odpowiadać za ich możliwości samoodnowy ale i zdolności do różnicowania (w komórkach ES opisano ekspresję 36 miRNA z czego specyficznych wydaje się 15 z nich) Rola miRNA

30 Zaburzenia ekspresji miRNA mogą przyczyniać się do rozwoju wielu chorób m.in. nowotworów Zaburzenia ekspresji miRNA mogą przyczyniać się do rozwoju wielu chorób m.in. nowotworów Mogą działać jako onkogeny jak i supresory Mogą działać jako onkogeny jak i supresory Rola miRNA

31

32

33

34 Różnice między siRNA, a miRNA siRNA pochodzi z dsRNA, miRNA pochodzi z ssRNA siRNA pochodzi z dsRNA, miRNA pochodzi z ssRNA siRNA zazwyczaj w 100% jest komplementarny z transkryptem, miRNA nie jest w 100% komplementarny siRNA zazwyczaj w 100% jest komplementarny z transkryptem, miRNA nie jest w 100% komplementarny prekursory siRNA nie tworzą struktury szpilki do włosów prekursory siRNA nie tworzą struktury szpilki do włosów siRNA (23-27 nukleotydów) są fragmentami dłuższymi od mi RNA (21-21 nukleotydy) siRNA (23-27 nukleotydów) są fragmentami dłuższymi od mi RNA (21-21 nukleotydy)

35 lincRNA klasa RNA działających w obwodach kontrolujących pluripotentność i różnicowanie large intergenic non-coding RNAs (lincRNAs)

36 lincRNA W genomie ssaków kodowanych jest wiele tysięcy długich niekodujących transkryptów: w tym klasa lincRNA zidentyfikowanych na podstawie charakterystycznych cech chromatyny w której zachodzi aktywna transkrypcja genów. Geny kodujące lincRNA posiadają interesujące właściwości, takie jak: zachowawczość ewolucyjna, ekspresja skorelowana z różnymi procesami komórkowymi oraz wiązanie kluczowych czynników transkrypcyjnych do ich promotorów. lincRNA oddziałują fizycznie z białkami regulatorowymi chromatyny.

37 lincRNA Dla kilku lincRNA, w badaniach typu utraty funkcji, wykazano że mają one wpływ na fenotyp komórki. Niektórzy podejrzewają, że geny lincRNA działają jedynie jako obszary wzmacniające, a transkrypty w postaci RNA, to wyłącznie przypadkowe produkty uboczne. Podobnie część badaczy uważa, że transkrypty lincRNA działają jako aktywatory transkrypcji w układzie cis, a w układzie trans jako represory.

38 lincRNA W doświadczeniach typu knockdown wykazano, że: wyciszenie ekspresji większości lincRNA w komórkach macierzystych typu zarodkowego (ES), miało silny wpływ na wzór ekspresji genów w komórkach ES, o wielkości porównywalnej do tej obserwowanej dla dobrze znanych białek regulatorowych w tych komórkach. wyciszenie ekspresji większości lincRNA w komórkach macierzystych typu zarodkowego (ES), miało silny wpływ na wzór ekspresji genów w komórkach ES, o wielkości porównywalnej do tej obserwowanej dla dobrze znanych białek regulatorowych w tych komórkach. dziesiątki lincRNA w badaniach typu utraty funkcji powodowały wyjście komórek ze stanu pluripotencji, a dziesiątki lincRNA w badaniach typu utraty funkcji powodowały wyjście komórek ze stanu pluripotencji, a kolejne dziesiątki lincRNA, które wprawdzie nie są niezbędne do utrzymania pluripotencji, działają jednak jako represory genów swoistych dla liniowo-specyficznych programów w komórkach ES. kolejne dziesiątki lincRNA, które wprawdzie nie są niezbędne do utrzymania pluripotencji, działają jednak jako represory genów swoistych dla liniowo-specyficznych programów w komórkach ES.

39 lincRNA Należą do obwodów molekularnych w komórkach ES, ponieważ większość z nich jest bezpośrednio regulowana przez krytyczne połączone z pluripotencją czynniki transkrypcyjne. 30% lincRNA fizycznie oddziałuje ze specyficznymi białkami regulatorowymi chromatyny, oddziałując w ten sposób na ekspresję genów.

40 lincRNA Dotychczas uzyskane wyniki, ukazują sieć regulatorową w komórkach ES, poprzez którą czynniki transkrypcyjne regulują bezpośrednio ekspresją genów lincRNA, a spośród których wiele może fizycznie oddziaływać z białkami chromatyny, wpływając na programy ekspresji genów i utrzymanie stanu pluripotencji komórek ES.

41 lincRNA wpływają na globalną ekspresję genów Pięć krótkich RNA o budowie spinki do włosów (ang. short hairpin RNA - shRNA) kodowanych przez konstrukcje na bazie lentiwirusów wycelowano przeciwko 226 lincRNA wykrytym wcześniej w komórkach ES. Pięć krótkich RNA o budowie spinki do włosów (ang. short hairpin RNA - shRNA) kodowanych przez konstrukcje na bazie lentiwirusów wycelowano przeciwko 226 lincRNA wykrytym wcześniej w komórkach ES. shRNA okazały się zdolne do redukcji ekspresji 147 lincRNA, średnio o około 75%, w porównaniu do ich zawartości endogennej w komórkach ES. shRNA okazały się zdolne do redukcji ekspresji 147 lincRNA, średnio o około 75%, w porównaniu do ich zawartości endogennej w komórkach ES. Każdy shRNA wprowadzono do komórek ES, z których po 4 dniach izolowano RNA i oznaczono całkowity profil transkrypcji, wykorzystując do tego mikromacierze cało- genomowe. Każdy shRNA wprowadzono do komórek ES, z których po 4 dniach izolowano RNA i oznaczono całkowity profil transkrypcji, wykorzystując do tego mikromacierze cało- genomowe. Jako znamienne zmiany ekspresji przyjęto te które przekraczały co najmniej 2x maksymalne wielkości wykryte w jakiejkolwiek z badanych kontroli negatywnych, a także cechowały się niskim stosunkiem wykrywalności błędów (ang. low false discovery rate - FDR) ocenianym dla wszystkich genów przy pomocy testów permutacji. Jako znamienne zmiany ekspresji przyjęto te które przekraczały co najmniej 2x maksymalne wielkości wykryte w jakiejkolwiek z badanych kontroli negatywnych, a także cechowały się niskim stosunkiem wykrywalności błędów (ang. low false discovery rate - FDR) ocenianym dla wszystkich genów przy pomocy testów permutacji.

42 lincRNA wpływają na globalną ekspresję genów Schemat doświadczeń zaburzania lincRNA. Komórki ES infekowano shRNA, a stopień wyciszenia wyliczano i najlepszy shRNA wybierano do badań profili ekspresji metodą macierzy, a zróżnicowaną ekspresję genów obliczano w odniesieniu do negatywnej kontroli shRNA.

43 lincRNA wpływają na globalną ekspresję genów Przykładowe wyciszenie lincRNA. Góra: lokus genomowy zawierający lincRNA. Dół: mapa termiczna 95 genów objętych wyciszeniem badanego lincRNA. [Wskazana ekspresja kontrolnych shRNA (czerwono) i ekspresja lincRNA shRNA (niebiesko).]

44 lincRNA wpływają na globalną ekspresję genów Rozkład liczbowy genów dla wyciszonych 147 lincRNA (niebieskie) i 40 dobrze znanych białek regulatorowych w komórkach ES (czerwono). Wskazano pięć białek regulatorowych specyficznych dla komórek ES. Dla 137 spośród 147 lincRNA (93%), knockdown miał znamienny wpływ na ekspresję genów, obejmując średnio 175 transkryptów kodujących białko, które podlegały wpływowi (zakres od 20 do 936).

45 lincRNA wpływają na globalną ekspresję genów Mimo, że niektóre pojedyncze lincRNA wydają się, przede wszystkim, hamować ekspresję genu, to knockdown lincRNA w większości porównań powoduje zarówno aktywację, jak i represję porównywalnej liczby genów. Aby ocenić specyficzność obserwowanych działań zbadano profile z drugim najlepszym z walidowanych wstępnie shRNA, który wpływał na 10 losowo wybranych genów lincRNA. We wszystkich przypadkach, drugi shRNA skierowany przeciwko temu samemu celowi dawał znamiennie podobny rezultat w zmianach ekspresji. Wyniki te wskazują, że przeważająca większość lincRNA ma porównywalne konsekwencje funkcjonalne w ogólnej ekspresji genów (w rozumieniu liczby genów i wpływu na wielkość ich ekspresji) znanych jako regulatory transkrypcji w komórkach ES.

46 lincRNA wpływają na ekspresję genów w sposób trans Wyniki knockdown: tylko 2 lincRNA miały wpływ na sąsiednie geny, tylko 2 lincRNA miały wpływ na sąsiednie geny, tylko 13 miało wpływ w zakresie 10 genów po obu stronach od miejsca ich położenia i tylko 13 miało wpływ w zakresie 10 genów po obu stronach od miejsca ich położenia i tylko 8 miało wpływ na geny położone nie dalej niż 300 kpz; tylko 8 miało wpływ na geny położone nie dalej niż 300 kpz; Uzyskane wartości nie odbiegają od tych stwierdzonych dla genów kodujących białka.

47 lincRNA wpływają na ekspresję genów w sposób trans Wydaje się, że lincRNA oddziałują na ekspresję głównie w układzie trans.

48 lincRNA utrzymują stan pluripotentności Regulacja stanu komórek ES obejmuje dwie składowe: 1)Utrzymanie programu pluripotencji i 2)represję programów różnicowania

49 lincRNA utrzymują stan pluripotentności Aktywność z promotora Nanog kierującego lucyferazą po stymulacji kontrolnymi shRNA (czarne) lub shRNA dla lucyferazy (zielone), wybrane regulatory kodujące białka (czerwone), lincRNA (niebieskie).

50 lincRNA utrzymują stan pluripotentności Względne wartości ekspresji mRNA Oct4 po knockdown wybranych genów kodujących białka (czerwone) i lincRNA (niebieskie) wpływających na natężenie ekspresji Nanog- lucyferaza. Pokazano wyniki dla najlepszego shRNA (Hairpin 1) i drugiego dobrego (Hairpin 2). Wszystkie knockdowny są znamienne z wartością P<0.01 błąd standardowy dla (n=4).

51 lincRNA utrzymują stan pluripotentności Morfologia komórek ES i barwienie immunofluorescencyjne Oct4 dla kontroli negatywnej hairpin (czarna linia) i hairpin przeciwko Oct4 (czerwona linia) oraz dwóm lincRNA (niebieska linia). Pierwszy wiersz pokazuje obrazy w jasnym polu, środkowy pokazuje immunofluorescencję Oct4, a trzeci barwienie DAPI jąder komórkowych.

52 lincRNA utrzymują stan pluripotentności 26 lincRNA miało duży wpływ na wielkość endogennej ekspresji Nanog. Dla wielu był on porównywalny do wpływu na wielkość po wyciszeniu (knockdown), znanych regulatorów genów kodujących białka takie jak Oct4 i Nanog.

53 lincRNA utrzymują stan pluripotentności lincRNA mają znaczenie w utrzymaniu stanu pluripotencji.

54 lincRNA w represji programów liniowych Aby ocenić czy lincRNA działają w represji programów różnicowania, całkowite wzory ekspresji genów po wyciszeniu lincRNAs była porównana do znanych z publikacji wzorów ekspresji pojawiających się w wyniku indukcji różnicowania komórek ES, a znamienność była oceniana na podstawie FDR z pochodnych permutacji. Badania obejmowały różnicowanie do endodermy, ektodermy, neuroektodermy, mezodermy i trofoektodermy. Pozytywną kontrolą w tych badaniach był wynik wskazujący, że po wyciszeniu Oct4 uzyskano wzór ekspresji charakterystyczny dla różnicowania do trofoektodermy, a po wyciszeniu Nanog wzór był charakterystyczny dla różnicowania do endodermy.

55 lincRNA w represji programów liniowych Zmiany ekspresji każdego z 30 lincRNA w porównaniu z 5 wzorami ekspresji genów. Każda kratka pokazuje znamienny pozytywny związek (czerwony, FDR, 0,01) dla Oct4 i Nanog (lewy) i dla lincRNA (prawy). Zidentyfikowano 30 lincRNA, dla których wyciszenie powodowało wzory ekspresji podobne do tych obserwowanych podczas różnicowania do specyficznych linii komórkowych. Wśród badanych lincRNA: 13 było związanych z różnicowanie do endodermy, 7 do ektodermy, 5 do neuroektodermy, 7 do mezodermy 2 do trofoektodermy.

56 lincRNA w represji programów liniowych Zmiany ekspresji po wyciszeniu Oct4 i Nanog (czarne słupki) i reprezentatywnych lincRNA (szare słupki) dla 5 genów markerowych linii komórkowych. Zmiany ekspresji (FDR <0.05) przedstawiono w skali logarytmicznej jako t-statystyczne porównane z zestawem kontroli negatywnych. Zgodnie z przewidzianym zaleznościami funkcjonalnymi większość (>85%) z 30 lincRNA było związanych ze specyficznymi liniami różnicowania pokazując wzrost ekspresji dobrze znanych genów markerowych zidentyfikowanych w wyniku wyciszenia (jak Sox17 - endoderma, Fgf5 - ektoderma, Pax6 - neuroektoderma, brachyury - mezoderma i Cdx2 - trofoektoderma). Fakt, że wyciszenie tych 30 lincRNA indukuje programy ekspresji genów związane z wczesnym różnicowaniem linii komórkowychwskazuje, że te lincRNA stanowią właściwą BARRIERĘ do takiego różnicowania.

57 lincRNA w represji programów liniowych Większość wyciszonych lincRNA (~85%), które indukują wzory ekspresji genów związane z tymi liniami komórkowymi nie powodowało różnicowania komórek takiego rodzaju jak po indukcji przez Nanog i ekspresję Oct4. Jest to zgodne z obserwacjami kilkunastu krytycznych regulatorów chromatynowych w komórkach ES, takich jak: kompleks polycomb; których utrata funkcji indukuje markery swoiste liniowo bez wywołania różnicowania. Przytoczone dane wskazują, że wiele lincRNA odgrywa ważne role regulacji stanu komórek ES, w tym utrzymania pluripotencji i represji specyficznego różnicowania linowego.

58 lincRNAs are targets of ES cell transcription factors Mapa termiczna przedstawiająca wyniki ChIP-Seq dla 9 czynników transkrypcyjnych (kolumny) w promotorach lincRNA (wiersze). Procent związanych lincRNA o obniżonej ekspresji na skutek wyciszenia czynnika transkrypcyjnego zaznaczono w kratkach. NA, nie mierzono. Prawa: przykłady lincRNA z dwóch zbiorów (core regulated i Myc regulated) pokazujące ich genomowe otoczenie i wiązanie czynnika transkrypyjnego.

59 lincRNA celują w czynniki transkrypcyjne w komórkach ES Lewy: mapa termiczna pokazując zmiany ekspresji lincRNA (wiersze) po wyciszeniu 11 czynników transkrypcyjnych (kolumny). Środek: wpływ wyciszenia Sox2, Oct4 i Nanog na natężenie ekspresji linc1405 (szary) i Oct4 (czarny). Prawy: wpływ wyciszenia Klf2, Klf4, n- Myc i Esrrb na natężenie ekspresji linc1428.

60 lincRNA wiążą różne białka chromatyny Schemat klas regulatorów chrmatynowych: czytelnicy (niebieski), pisarze (pomarańczowe) i czyściciele (zielone).

61 lincRNA wiążą różne białka chromatyny Mapa termiczna pokazując wzbogacenie 74 lincRNA (wiersze) 1 z 12 kompleksów regulatorowych chromatyny (kolumny). Nazwy zakodowane kolorami odnoszącymi się do mechanizmów regulatorowych chromatyny. Główne skupiska są wskazane liniami pionowymi z opisem składników chromatyny.

62 Model integracji lincRNA w molekularnycm obwodzie komórki. Lewy: czynniki transkrypcyjne swoiste dla komórek ES (takie jak: Oct4, Sox2 i Nanog) wiążą się z promotorem genu lincRNA i kierują jego transkrypcją. lincRNA wiąże się do ogólnych białek regulatorowych, powodując powstawanie kompleksów ryboproteinowych specyficznych dla typu komórki. W wyniku różnych kombinacji oddziaływań białka kompleks lincRNA-białko umożliwia różne programy transkrypcyjne. Prawy: podobny proces może zachodzić w komórkach różnego typu ze swoistymi czynnikami transkrypcyjnymi regulującymi lincRNA, tworząc komórkowo swoiste kompleksy RNA-białko i regulujące komórkowo swoiste programy ekspresji.

63 Podsumowanie Analiza ekspresji lincRNA w komórkach ES z wykorzystaniem metody wyciszania ujawniła, że lincRNA są rzeczywiście funkcjonalne i działają przede wszystkim w typie oddziaływań trans na globalną ekspresję genów. lincRNA są kluczowymi składnikami połączeń transkrypcyjnych w komórkach ES, które są ważne funkcjonalnie dla utrzymania stanu pluripotencji i wiele z nich zanika podczas różnicowania.

64 Podsumowanie Możliwy jest model, w którym odmienny zestaw lincRNA jest transkrybowany w danym typie komórek i oddziałuje z powszechnymi regulatorowymi kompleksami białkowymi aby wytworzyć komórkowo swoiste kompleksy ryboproteinowe, koordynujące komórkowo swoiste programy ekspresji genów. Wiele spośrów lincRNA oddziału z licznymi różnymi kompleksami białkowymi, które mogą działać jako komórkowo swoiste elastczne rusztowania zbliżające kompleksy białkowe aby utworzyć olbrzymie jednostki funkcjonalne. Podobny model wyjaśnia oddziaływania w drożdżowym RNA telomerazy, a także dla XIST i HOTAIR lincRNA.

65 DZIĘKUJĘ ZA UWAGĘ K O N I E C


Pobierz ppt "GEN ROZSZERZENIE DEFINICJI NA WSZYSTKIE TRANSKRYBOWANE SKEWNECJE DNA."

Podobne prezentacje


Reklamy Google