Pobieranie prezentacji. Proszę czekać

Pobieranie prezentacji. Proszę czekać

Wykład 2 Metody biologii molekularnej roślin. Podstawowe techniki biologii molekularnej stosowane w badaniach roślin Klonowanie; Biblioteki genowe; Banki;

Podobne prezentacje


Prezentacja na temat: "Wykład 2 Metody biologii molekularnej roślin. Podstawowe techniki biologii molekularnej stosowane w badaniach roślin Klonowanie; Biblioteki genowe; Banki;"— Zapis prezentacji:

1 Wykład 2 Metody biologii molekularnej roślin

2 Podstawowe techniki biologii molekularnej stosowane w badaniach roślin Klonowanie; Biblioteki genowe; Banki; Bazy danych; Analiza makrocząsteczek/ elektroforeza; PCR; Sondy: Southern-, Northern-, Western-blotting, Immunodetekcja; Hybrydyzacja in situ; FISH; Transkrypcja/translacja in vitro; Ekspresja cDNA; Badania białek, Chromatografia powinowactwa; System dwuhybrydowy; Bioinformatyka

3 Klonowanie Procedura zmierzająca do uzyskania pojedynczych genów w postaci fragmentów DNA chromosomowego (genomowego) lub kopii transkryptów (cDNA – complementary DNA). Polega na wykorzystaniu innego organizmu (np. drożdży lub E. coli) do zreplikowania fragmentu DNA. Wymaga wektora (autonomicznie replikującego się fragmentu DNA). Dla bakterii wektorami są plazmidy lub wirusy, np. bakteriofag labmda (λ) DNA jest przecinany w określonych miejscach enzymami restrykcyjnymi. Powtórne łączenie przeciętych fragmentów DNA wymaga ligacji za pomocą enzymu: ligazy DNA.

4 Podstawowy schemat klonowania

5 Przykładowy protokół Transformacja E. coli plazmidem

6 Przygotowanie komórek kompetentnych (metoda z CaCl 2 ) 1. Załóż hodowlę kolonii E. coli na szalkach z LB. 2. Przenieś pojedynczą kolonię do 100 ml pożywki LB w 500 ml kolbie z odpowiednim antybiotykiem. Prowadź hodowlę w wytrząsarce w 37 o przy 300 obr./min aż do połowicznej fazy logarytmicznej (O.D. 600nm ok. 0.6). 3. Przenieś hodowlę do wyziębionych 50 ml probówek wirówkowych. Schłodź w lodzie przez 10 min.. 4. Zwirój komórki przy 3000 obr./min w 4 o C przez 10 min. 5. Zlej supernatant. Zawieś osad w 20 ml lodowatego 0.1M CaCl Trzymaj w lodzie przez 5-10 min. 7. Zwirój komórki powtórnie przy 3000 obr./min w 4 o C przez 10 min. 8. Zdekantuj supernatant. Postaw probówki odwrócone na bibule, aż do ścieknięcia cieczy. 9. Zawieś osad w 2 ml lodowatego 0.1M CaCl 2.

7 Transformacja 10. Przenieś 200µl kompetentnych komórek do probówki do mikrowirówki. 11. Dodaj 10µl plazmidu (2 ng/µl). 12. Wymieszaj zawartość i umieść w lodzie na 30 min. 13. Przenieś probówki do łaźni o temp. 42 o C na 90 sek. 14. Schłodź probówki w lodzie przez 1-2 min. 15. Dodaj 800µl pożywki LB. Inkubuj w 37 o C przez 45 min. 16. Rozprowadź różne ilości transformantów na szalkach LB z ampiciliną (30µg/ml): (i) 10µl + 90 µl LB (ii) 100µl bez rozcieńczania LB. 17. Inkubuj szalki w 37 o C przez noc. 18. Oblicz wydajność transformacji (liczba koloni/ug DNA)

8 Warianty klonowania

9 Biblioteki genowe Zbiory pojedynczych genów (fragmentów DNA) utrzymywane w oddzielnych bakteriach. Stanowią materiał wyjściowy do poszukiwania genów. Biblioteki cDNA : odwzorowania transkryptów (RT-PCR) – sekwencje kodujące genów. Biblioteki genomowe: reprezentują cały genom (geny i rejony międzygenowe); geny: sekwencje kodujące (introny + eksony) i regulatorowe (promotory) Biblioteki genomowe: w różnych typach wektorów, np. W plazmidach – od kilkuset do kilku tysięcy pz. do uzyskiwania sond hybrydyzacyjnych do diagnostyki lub mapowania genów (RFLP) W wektorze fagowym (kosmidy) (10-35 Kb) – do uzyskiwania komplentnych genów W YAC (Yeast Artifical Chromosome) lub BAC do klonowania fragmentów chromosomów ( Mb) Przeszukiwanie bibliotek: sondy genowe lub PCR.

10 Banki i Bazy danych Postęp technik sekwencjonowania w ostatnich dekadach. Do dziś zakończono sekwencje kilkudziesięciu genomów bakteryjnych i genomów prostych eukaryota (np. Saccharomyces cerevisiae -drożdże piekarskie) Dostępne są też całe sekwencje genomowe wielkomórkowych eukaryota, w tym: psa, mszy, szympansa, Drosophila, C. elegans i A. thaliana, ryżu Human Genome Project, zakończył się zsekwencjonowaniem wszystkich 24 ludzkich chromosomów. Szczegółowe dane wciąż spływają. Zasoby baz danych np. GeneBank lub EMBL, rosną w tempie wykładniczym. Ogromna ilość informacji wymaga b. starannej organizacji przechowywania i analizy danych. Zastosowanie informatyki w biologii doprowadziło do powstania dziedziny zwanej Bioinformatyką.

11 Banki i Bazy danych-przeszłość i prognoza Większość biologicznych baz danych zawiera informacje o sekwencjach nukleotydowych i aminokwasowych. Istnieją także bazy danych zawierające informacje o strukturalnych i biochemicznych cechach organizmów. Wartość informacyjna i prostota zastosowania informacji o sekwencjach powodują, że są one najczęściej wykorzystywane. 2008

12 Rzeczywistość

13 Przyrost liczby biologicznych baz danych

14 Bioinformatyka Najprostszym i podstawowym zadaniem bioinformatyki jest tworzenie i utrzymywanie baz danych informacji biologicznych. Większość tych baz zawiera sekwencje kwasów nukleinowych (i pochodzące z nich sekwencje aminokwasowe). Przechowywanie i organizacja informacji o miliardach nukleotydów nie jest zadaniem trywialnym; zaprojektowanie bazy danych i rozwój interfejsu umożliwiającego badaczom dostęp do zgromadzonej informacji i jej uzupełnianie o nowe dane - to tylko początek.

15 Bioinformatyka/Biologia obliczeniowa Najważniejszym celem bioinformatyki jest analiza informacji o sekwencjach. Zadanie to realizuje biologia obliczeniowa (Computational Biology), która zajmuje się: Odnajdywaniem genów w sekwencji DNA różnych organizmów. Opracowywaniem metod przewidywania struktury i/lub funkcji nowo odkrywanych białek i niekodujących RNA. Grupowaniem sekwencji białkowych w rodziny pokrewnych sekwencji i rozwojem metod pozwalających na modelowanie białek. Porównywaniem (alignment) pokrewnych białek i tworzeniem drzew filogenetycznych pozwalających na wyciąganie wniosków ewolucyjnych.

16 Analiza makrocząsteczek/ elektroforeza Białka: SDS-PAGE Wzorce masy cząsteczkowej białek (w nanogramach) rozdzielone w 12% żelu poliakrylamidowym z SDS i wybarwione barwnikiem Coomassie Fluor Orange

17 Analiza makrocząsteczek/ elektroforeza Rozdzielczość SDS-PAGE Analiza: Z dobrego żelu SDS-PAGE można określić: –względną M.Cz. w D lub kD jednego białka w stosunku do drugiego –Dokładną M.Cz. białka, jeśli dostępne są odpowiednie wzorce.

18 Elektroforeza białek – różne metody detekcji Wykrywanie glikoprotein wśród innych białek w SDS-PAGE za pomocą zestawu do barwienia glikoprotein (Glycoprotein Gel Stain Kit). Markery M.Cz. glikoprotein zawierające na przemian białka glikozylowane i nie glikozylowane rozdzielono w 13% żelu poliakrylamidowym. Żel wybarwiono barwnikiem SYPRO Ruby wykrywającym wszystkie 8 białek markerowych (lewa ścieżka). Żel wybarwiono następnie na glikoprioteiny wykrywając: 2- makroglobulinę, oksydazę glukozową, 1-glikoproteinę i awidynę (prawa ścieżka)

19 Elektroforeza białek – barwienia wybiórcze Dwukrotne rozcieńczenia trzech różnych lizatów E. coli, każdy wyrażający fuzję rekombinowanego białka z oligohistydyną, rozdzielono w żelu poliakrylamidowym. Po elektroforezie żel wybarwiono barwnikiem Pro-Q Sapphire 365 wykrywającym oligohistydynę (górny żel). Po sfotografowaniu, żel wybarwiono barwnikiem SYPRO Ruby (dolny żel).

20 Elektroforeza białek – żele 2D (dwuwymiarowe) Porównanie dwóch próbek białkowych rozdzielonych na żelu 2-D. Białka z normalnej i nowotworowej wątroby rozdzielono na dwóch żelach 2-D i wybarwiono SYPRO Ruby. Obrazy wybarwionych żeli zeskanowano. Obrazy wybarwionych żeli pokolorowano na różowo lub zielono i nałożono. Zielone plamki – białka eksprymowane w wątrobie nowotworowej, różowe – w wątrobie normalnej. Czarne plamki odpowiadają białkom eksprymowanym w obu tkankach.

21 Dostępne spektrometry mas (IBB PAN) Q-TOF LTQ-FT-ICR Linear Ion Trap Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Liczba białek identyfikowanych w jednym przebiegu HPLC-MS MudPIT300? Spektrometr Mas

22 Otrzymywanie jąder komórkowych Frakcjonowanie

23 Identyfikacja białek W 9-ciu przebiegach HPLC/FT-ICR zidentyfikowano 4255 białek W pojedynczym przebiegu HPLC/FT-ICR można zidentyfikować ponad 1000 białek Wyniki Białka z różnych frakcji zidentyfikowane w jednym przebiegu

24 MudPIT Multidimentional Protein Identification Technique Zalety metody: możliwość wykrycia około 1000 białek w próbce szybka i mało pracochłonna metoda nadaje się do analizy całych proteomów Wady metody: trudna analiza danych skomplikowany sprzęt HPLC długotrwałe przebiegi HPLC-MS ( około doby na próbkę)

25

26 Elektroforeza DNA (fragmentacja DNA w apoptozie) DNA wyizolowano z komórek HL-60 traktowanych kamptotecyną, rozdzielono w żelu agarozowym i wybarwiono SYBR Green I, barwnikiem wykrywającym kwasy nukleinowe. Widać drabinkę fragmentów o wielkości od 200 to 5000 pz charakterystyczną dla komórek w stanie apoptozy.

27 Elektroforeza DNA po trawieniu enzymem restrykcyjnym HaeIII Seria rozcieńczeń DNA faga PhiX174 RF trawionego enzymem Hae III i rozdzielonego w 5% żelu poliakrylamidowym, barwienie SYBR Green. Prążki widoczne po naświetleniu żelu światłem UV o długości 254 nm.

28 Sondy (probes)/hybrydyzacja Southerna

29 Wykorzystanie hybrydyzacji Southern do analizy metylacji DNA Arabidopsis w 180 pz powtórzeniach centromerowych (wg. Wierzbicki i Jerzmanowski, Genetics 2005) HpaII CCGGMspI CCGG

30 Elektroforeza RNA Seria rozcieńczeń16S i 23S rybosomalnego RNA (rRNA) z E. coli po rozdziale w nie denaturującym 1% żelu agarozowym i wybarwieniu barwnikiem SYBR Green II..

31 Sondy (probes)/hybrydyzacja Northern Przeniesiony na membranę RNA (po elektroforezie) jest hybrydyzowany z radiaktywnymi sondami.

32 Analiza Northern: W całkowitym RNA Arabidopsis znajduje się małe RNA o sekwencji homologicznej do rejonu 3`FLC użyta sonda ATG TAG liście rozety łuszczynki liście pędu pędkwiatysiewki 30nt 20nt sonda do rejonu 3`FLC EtBR

33 Zasada i zastosowania PCR

34 Analiza poziomu transkrypcji wybranych genów podczas rozwoju A. thaliana u roślin dzikich i mutantów atswi3c-1 i atswi3d-1 (wg. Sarnowski et al. Plant Cell 2005)

35 Wykorzystanie RT-PCR do analizy wpływu supresji histonu H1w Arabidopsis na poziom mRNA (wg. Wierzbicki i Jerzmanowski, Genetics 2005) RT-PCR

36 Wykorzystanie PCR do analizy metylacji rybosomalnego DNA (wg. Wierzbicki i Jerzmanowski, Genetics 2005)

37 Transkrypcja/translacja in vitro

38 Ekspresja cDNA w jeden dzień

39 Systemy do ekspresji cDNA

40 Immunodetekcja/Western blotting

41 Zmiany modyfikacji histonów H3 i H4 w odpowiedzi na stres chłodu w komórkach TBY-2 (Sokół et al.. niepublik.) 0,1 3 st. sacharozy w % anty-P(Ser10)-H3 0,1 3 stężenie sacharozy w % min anty-P(Ser10)- Ac(Lys14)-H3 anty-Ac-H4 min ,1 3 stężenie sacharozy w % żel SDS western-blot żel SDS western-blot

42 Badania białek - Chromatografia powinowactwa

43 Analiza chromatyny za pomocą metody ChIP – czego szukamy? H3 K9 diME euchromatynaheterochromatyna

44 ATG TAG gen FLC Struktura genu FLC

45 przeciwciała specyficzne do H3 di-meK9 amplifikacja PCR wzbogaconych fragmentów metoda ChIP - 1 (Chromatin Immuno Precipitation)

46 Jenuwein T metoda ChIP – specyficzność przeciwciał

47 ChIPNoAB ŁUSZCZYNKI SIEWKI ŁUSZCZYNKI SIEWKI Ta3 rejon 3`FLC Wynik analizy: w łuszczynkach rejon 3`FLC jest związany ze znacznikiem H3 K9 di-methyl

48 Wzbogacenie zanaczonych reionów w H3 di-me K9; ChIP nad Input Wzbogacenie w stosunku do kontroli Wynik analizy: znacznik H3 K9 di- methyl jest ograniczony do rejonu 3`FLC ATG TAG

49 Wykorzystanie GFP do ustalenia, czy siRNA do 3FLC działa w trans? FLC locus ATG TAG GFP5ER 35S Promoter 35S Terminator sensor construct GFP5ER 35S Promoter 35S Terminator negative control construct GFP5ER 35S Promoter 35S Terminator 300nt fragment of AtSN1 positive control construct GFP5ER 35S Promoter 35S Terminator 35S GFP

50 Fluorescencji GFP w transgenicznych siewkach 35S GFP sensor positive control negative control

51 Fluorescencja GFP w transgenicznych łuszczynkach 35S GFP plants Sens b

52 Sondy/Detekcja białek w komórkach Włókna aktynowe u płazińca Archimonotresis sp. znakowane fluorescencyjnie falloidyną dla uwidocznienia systemu mięśni poprzecznych, okrężnych i diagonalnych. Duży jasny pierścień z włóknami mięśniowymi rozchodzącymi się promieniście na zewnątrz to gardziel, mały jasny pierścień po przeciwnej stronie jest częścią układu reprodukcyjnego.

53 Sondy/Jednoczesna detekcja kilku białek Komórki nabłonkowe; sondy do aktyny, mitochondriów i fosforylowanej formy histonu H3 Aktyna: niebieska fluorescencja Alexa Fluor 350 phalloidin, Fosfo H3 królicze przeciwciało p- ko fosfo-H3 H3 antibody znakowane Alexa Fluor 555 Rabbit IgG (czerwona fluorescencja). Mitochodria: endogenna biotyna znakowana streptawidiną wykrywana przez królicze przeciwciało p-ko streptawidynien znakowane Zenon Alexa Fluor 488 Rabbit IgG (zielona fluorescencja)

54 Jednoczesna detekcja białek i DNA Komórki nabłonka inkubowane z barwnikiem MitoTracker Red uwidoczniającym mitochondria. Aktyna wybarwiona fluorescencyjnie falloidyną Jądra komórkowe wybarwione DAPI

55 Detekcja sekwencji chromosomowych za pomocą FISH -Fluorescent In situ Hybridization

56 FISH na chromosomach Sondy DNA specyficzne do określonych rejonów poszczególnych chromosomów są znakowane markerami fluorescencyjnymi i hybrydyzowane do rozmazów chromosomowych. Wzmocniony komputerowo obraz chromosomów po hybrydyzacji z sondą

57 Chromosome painting – malowanie chromosomów Sondy DNA specyficzne do odpowiednich rejonów w poszczególnych chromosomach są przyłączane do markerów fluorescencyjnych i hybrydyzowane do preparatu zawierającego rozmaz chromosomów. Zdjęcie pokazuje wygenerowany przez komputer obraz w sztucznych kolorach, w którym małe różnice w długości fali widma fluorescencji, po wzmocnieniu, tworzą wyraźne barwy pierwotne. Kombinacja sond hybrydyzujących do poszczególnych chromosomów tworzy dla każdego z nich niepowtarzalny wzór.

58 Hybrydyzacja in situ: sondy do sekwencji satelitarnych ludzkich chromosomów 1, 15 i 17 Sondy do sekwencji satelitarnych chromosomów 1, 15 i 17 znakowane odpowiednio: biotyną-11-dUTP, ChromaTide Texas Red- 12-dUTP i ChromaTide Oregon Green dUTP.

59 Analiza in situ na chromosomach metafazalnych Ludzkie chromosomy metafazalne hybrydyzowane do sond znakowanych fluorescencyjnie, odpowiadających dwóm blisko sąsiadującym rejonom. Sondy do rejonów 1p34–35 i 1p36 znakowano odpowiednio: Oregon Green 488 i Fluor 594. Chromosomy dodatkowo barwiono DAPI.

60 Jednoczesne wykrywanie za pomocą FISH trzech genów w preparacie zarodka Drosophila Różnie znakowane sondy cRNA wykrywane za pomocą przeciwciał ze znacznikami fluorescencyjnymi: Oregon Green, HRP– streptawidina/Fluor 568 i Fluor 647.

61 Drożdżowy system dwuhybrydowy - 1

62 System dwuhybrydowy - 2

63 System dwuhybrydowy - 3

64 pCL1 Positive control AtSWI3B-AD AtSWI3B-BD AtSWI3C-AD AtSWI3B-BD AtSWI3B-AD AtSWI3A-BD Negative controls AtSWI3B-BD Lift filter assay for β-galactosidase activity AtSWI3B-AD AtSWI3C-AD AtSWI3A-BD BSH-BD Lift filter assay for β-galactosidase activity AtSWI3A-AD BSH-BD AtSWI3C-AD BSH-BD AtSWI3A-AD AtSWI3A-BD AtSWI3C-AD AtSWI3A-BD FCA-AD AtSWI3A-BD FCA-PhD-AD AtSWI3A-BD AtSWI3A-AD FCA-PhD-AD Lift filter assay for β-galactosidase activity Analiza za pomocą drożdżowego systemu dwuhybrydowego oddziaływań AtSWI3, BSH i FCA, białek Arabidopsis (wg. Sarnowski et. al. 2002) AtSWI3B-AD BSH-BD

65 ATSWI3C BSH ATSWI3A ATSWI3B FCA ATSWI3D AtBRM Farrona et al., 2004 ATSWP73A HD2B NAM PAM1 PAM2 PRL2 AMIDASE Mapa Oddziaływań białek SWI3 w Arabidopsis, wg. Sarnowski et al., niepublikowane

66 BIP2 (3-32) HD2A ATSWI3C ATSWI3A ATSWI3B FCA ATSWI3D AtBRM ATSWP73A HD2B PRL2 AMIDASE PRL1 AKIN 10/11 BSH CobW PIRIN Farrona et. al., 2004 SAHH Interactions identified In Csaba Koncz laboratory Interactions verified in pGBT9/pGAD424 system Interactions verified in pGBT9/pACT2 system Weak interactions identified in pGBT9/pACT2 system Interactions identified by other researchers from our laboratory in the pGBT9/pGAD424 system Proteins studied in Csaba Koncz laboratory Core subunits of the SWI/SNF chromatin remodeling complex except for ATPase plus the FCA protein Proteins identified through the yeast two hybrd screen ATPase BIP1 (1-57) PUX2 SRC2 ANAC102 JMJC RPT3 AAA ATGP4 Di19 COP9 E3 ATAF2 ARM BIP3 (3-45) RPL12 esterase family protein BIP5 (1-30) BIP4 (3-46) BIP6 (11-16) BIP7 (11-17) Sarnowski,Rolicka,Ryńska,Koncz, Jerzmanowski - niepublikowane


Pobierz ppt "Wykład 2 Metody biologii molekularnej roślin. Podstawowe techniki biologii molekularnej stosowane w badaniach roślin Klonowanie; Biblioteki genowe; Banki;"

Podobne prezentacje


Reklamy Google