Pobieranie prezentacji. Proszę czekać

Pobieranie prezentacji. Proszę czekać

Produkcja ludzkich rekombinowanych przeciwciał monoklonalnych metodą ekspresji fagowej.

Podobne prezentacje


Prezentacja na temat: "Produkcja ludzkich rekombinowanych przeciwciał monoklonalnych metodą ekspresji fagowej."— Zapis prezentacji:

1 Produkcja ludzkich rekombinowanych przeciwciał monoklonalnych metodą ekspresji fagowej

2 Komórki szpiczaka Zamrażanie komórek hybrydomy Wyodrębnianie pozytywnych klonów Immunizacja Komórki śledziony Fuzja Komórki hybrydomy Test na przeciwciała Subklonowanie Produkcja przeciwciał in vitro Produkcja przeciwciał in vivo Przeciwciała monoklonalne

3 Produkcja przeciwciał monoklonalnych metodą PHAGE DISPLAY

4 ADAM17

5 Cel projektu: Stworzenie specyficznego inhibitotra hamującego aktywność proteolityczną sekretazy ADAM17 Stworzenie i wyselekcjonowanie aptameruRNA (lub DNA) stworzenie i wyselekcjonowanie fragmentu przeciwciała scFV (ang. single chain variable fragment) metodą ekspresji fagowej

6 Co to takiego rekombinowane przeciwciało w formacie scFV? Fc Fab Fv Linker Budowa przeciwciała Budowa przeciwciała rekombinowanego scFV Fv

7 Fagemidowa biblioteka ludzkich rekombinowanych przeciwciał monoklonalnych Tomlinson I+J wektor fagemidowy pIT2 M13 ori colE1 ori amp lac promoter scFV myc pIII

8 Tomlinson I+J : rozmiar biblioteki I 1.47x10 8 J 1.37x10 8

9 Budowa faga filamentarnego

10 fagemid HL Jak to działa? Bakterie - biblioteka fagemidów fagemid H L Fag pomocniczy KM13 Fagi potomne wykorzystywane do selekcji + Infekcja białko pIII białko pIII-scFV ssDNA Ampicylina Kanamycyna

11 Immunoselekcja - wyszukiwanie fagów wiążących antygen Fagi specyficznie wiążące antygen Fagi negatywne Fagi specyficznie wiążące antygen Fagi negatywne

12 Fagi specyficznie wiążące antygen Elucja przy pomocy trypsyny Mianowanie i amplifikacja pozytywnych fagów Fagi poliklonalne

13 fagemid H L Trypsyna Fagi puste są nieinfekcyjne Fagi z scFv po działaniu trypsyny mogą infekować bakterie fagemid H L Proteoliza białka pIII przez trypsynę

14 Jak mianuje się pozytywne fagi? Fagi wiążące antygen Bakterie TG1 Tr + Infekcja Podłoże z ampicyliną Liczymy kolonie bakterii

15 Jak amlifikuje się pozytywne fagi? Fagi wiążące antygen Bakterie TG1 Tr + Infekcja Pożywka z ampicyliną Bakterie TG1 Tr z fagemidami kodującymi scFv wiążące antygen phage(mid) HL

16 HL I znów fag pomocniczy phage(mi d) H L Fag pomocniczy KM13 Fagi potomne wiążące antygen + Infekcja Kolejna runda immunoselekcji na antygenie Bakterie TG1 Tr z fagemidami kodującymi scFv wiążące antygen

17 Miano fagów po poszczególnych rundach immunoselekcji na metADAM17 [cfu/ml] Biblioteka I: Biblioteka J Runda I 9.5 x x10 5 RundaII 1.7 x x 10 7 RundaIII 1.2 x x 10 10

18 Miano fagów po poszczególnych rundach immunoselekcji na metADAM17 [cfu/ml] Biblioteka I: Biblioteka J Runda I 9.5 x x10 5 RundaII 1.7 x x 10 7 RundaIII 1.2 x x Testowanie wyodrębnionych fagów poliklonalnych Fagi specyficznie wiążące antygen HRP Przeciwciała rozpoznające faga KM13

19 Poliklonalnay fagowy test ELISA anty-metADAM17 Biblioteka I Biblioteka J Runda I II III I II III

20 Jak z populacji poliklonalnych fagów wiążących metADAM17 wyodrębnić fagi monoklonalne? Szalki z bakteriami po mianowaniu Hodowla poszczególnych kolonii na płytce 96-studniowej 1 2 Infekcja bakterii Fagiem KM13 3 Monoklonalne fagi potomne analizowane testem ELISA

21 Monoklonalny fagowy test ELISA anty ADAM17 I II III

22 Ale jak otrzymać rozpuszczalne scFV?

23 Infekcja bakterii HB2515 monoklonalnymi fagami anty metADAM17 pozwala na produkcję rozpuszczalnych scFV

24 Immunoselekcja na komórkach ADAM17 + ADAM17 - Biotynylacja Fagi Streptawidyna z kuleczkami magnetycznymi m m m Rozdzielenie komórek na seperatorze magnetycznym m m m Elucja fagów które związały się tylko do komórek ADAM+

25 Oczyszczanie scFV I.Chromatografia powinowactwa z wykorzystaniem białek bakteryjnych A oraz L. II.Chromatografia powinowactwa na złożach z jonami niklu lub wolframu. III.Chromatografia powinowactwa z wykorzystaniem przeciwciał wiażących metkę c-myc.


Pobierz ppt "Produkcja ludzkich rekombinowanych przeciwciał monoklonalnych metodą ekspresji fagowej."

Podobne prezentacje


Reklamy Google