Pobieranie prezentacji. Proszę czekać

Pobieranie prezentacji. Proszę czekać

Współczesne metody analiz genetycznych Katedra Onkologii Zakład Genetyki i Patomorfologii PUM Anna Jakubowska.

Podobne prezentacje


Prezentacja na temat: "Współczesne metody analiz genetycznych Katedra Onkologii Zakład Genetyki i Patomorfologii PUM Anna Jakubowska."— Zapis prezentacji:

1 Współczesne metody analiz genetycznych Katedra Onkologii Zakład Genetyki i Patomorfologii PUM Anna Jakubowska

2 Genom Chromosom Gen Region międzygenowy http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Human_genome_to_genes.png

3 rozpoczęcie HGP – 1990 (Human Genome Project) wstępny opis sekwencji – 2000 (Venter et al., Science 2001; Lander et al., Nature 2001) zakończenie sekwencjonowania – 2003 oficjalne zakończenie HGP – 2004 (International Human Genome Sequencing Consortium, Nature 2004 ) Poznanie genomu człowieka

4 3 274 571 503 pz ~ 2% to sekwencje kodujące 21 911 genów kodujących białka 8 483 genów kodujących RNA 12 599 pseudogenów ~ 98% to sekwencje niekodujące introny oraz sekwencje międzygenowe 23 326 320 SNPs (polimorfizmy pojedynczego nukleotydu) ~ 8 400 regionów CNV (duplikacje lub delecje odcinków DNA o długości >500 zasad) Struktura genomu człowieka (http://www.ensembl.org/Homo_sapiens/Info/StatsTable)

5 Geny funkcja wielu genów wciąż niepoznana identyfikacja genów lub specyficznych stref genetycznych związanych z rozwojem chorób: badania asocjacyjne sekwencjonowanie genomu

6 analiza wybranych markerów – kandydatów analiza markerów pokrywających cały genom, tzw. GWAS (Genome – Wide Association Study) potocznie nazywana skanowaniem genomu Badania asocjacyjne

7 GWAS Badanie przypadek - kontrola (case - control), w którym analizuje się związek pomiędzy występowaniem określonej cechy klinicznej a SNPs lub CNVs rozmieszczonymi w całym genomie AB C AC ABCBB SNP CNV http://www.snipscreen.com/genetics.php

8 Założenia GWAS badanie dużej liczby polimorfizmów o największej zmienności międzyosobniczej badanie jak największej grupy osób chorych i zdrowych

9 Chorzy Zdrowi DNA Porównanie Identyfikacja SNP związanych z chorobą http://cpmc.coriell.org/Sections/Medical/GeneInteraction_mp.aspx?PgId=93

10 Badania GWAS – kluczowe zasady homogenność grupy badanej pod względem analizowanej cechy liczna grupa kontrolna oraz badana walidacja

11 Etapy GWAS Garcia-Closas M, Chanock S Clin Cancer Res 2008;14:8000-8009 ©2008 by American Association for Cancer Research Przypadki i kontrole Badane SNPs I etap II etap III etap Mapowanie zmian Analiza funkcjonalna http://clincancerres.aacrjournals.org/content/14/24/8000/F3.expansion.html

12 Polimorfizmy dla GWAS wysoka częstość, MAF (minor allele frequency) >5% ~7 mln SNP o częstości MAF >5% ~4 mln SNP o częstości 1-5% brak sprzężenia SNP nie powinny znajdować się w genomie blisko siebie w tzw. nierównowadze sprzężeń (linkage disequilibrium) wykorzystanie mikromacierzy Affymetrix Illumina

13 Projekt HapMap międzynarodowe przedsięwzięcie obejmujące Japonię, Kanadę, Chiny, Nigerię i USA w celu identyfikacji oraz określenia częstości zmian polimorficznych w genomie ludzkim w różnych populacjach 270 osób: 90 z Nigerii 45 z Japonii 45 z Chin 90 z Europy północnej i zachodniej

14 Analiza mikromacierzy wytworzenie mikromacierzy naniesienie na płytkę gotowych lub zsyntetyzowanych in situ sond długości 25 - 70 nukleotydów http://www.affymetrix.com Sonda oligonukleotydowa mikromacierz

15 Analiza mikromacierzy hybrydyzacja DNA na płytce zawierającej sondy http://www.affymetrix.com

16 Analiza mikromacierzy skanowanie http://www.affymetrix.com

17 Analiza mikromacierzy analiza ilościowa

18 Analiza mikromacierzy Affymetrix Illumina

19 Affymetrix chip Affymetrix's Genome-Wide Human SNP Array 6.0 zawiera sondy dla 906 600 SNP i 946 000 CNV strategia wyboru SNP: tylko połowa w oparciu o projekt HapMap, tzw. haplotype - tagging tagSNPs, reszta to dowolne SNPs występujące w genomie sondy 25-nukleotydowe, 4-6 kopii/zmianę detekcja hybrydyzacja wyznakowanego DNA

20 http://www.affymetrix.com/estore/browse/products.jsp?categoryIdClicked=&productId=131534#1_1 Trawienie enzymami restrykcyjnymi Ligacja z adapterem Nsp lub Sty Amplifikacja PCR z jednym starterem Oczyszczenie próbki Fragmentacja, znakowanie końców Hybrydyzacja

21 Illumina chip HumanOmni2.5-Quad BeadChip zawiera > 2.45 milliona sond do badania SNPs i CNVs strategia wyboru SNPs: w oparciu o projekt HapMap, tzw. haplotype - tagging tagSNPs sondy 50-nukleotydowe, 1/zmianę detekcja wydłużanie sond z dobudowaniem znakowanych nukleotydów

22 http://www.illumina.com/technology/infinium_hd_assay.ilmn Genomowe DNA (200 - 400 ng) Amplifikacja DNA Fragmentacja DNA Hybrydyzacja DNA z sondą Wydłużanie sond z dobudowaniem wyznakowanych nukleotydów 2-etapowa detekcja Etap I Etap II

23 Zestawienie wykonanych GWAS ~ 600 GWAS obejmujących różne grupy i populacje 150 różnych zespołów np. cukrzyca typu I i II, choroba Crohna, choroba Alzheimera, schizofrenia, udar, choroby serca, nowotwory złośliwe, otyłość > 50 000 SNP wyselekcjonowanych do walidacji zidentyfikowano ~800 SNP związanych z chorobami (p<5×10 -8 ) Johnson and O'Donnell, BMC Medical Genetics 2009 Manolio, NEJM 2010

24 Manolio et al., NEJM 2010

25 Badanie Wellcome Trust 2005-2007 8 ważnych schorzeń wieloczynnikowych 19 000 osób (chorych i zdrowych) 500 000 polimorfizmów (SNPs i CNVs) 200 badaczy, 9 milionów funtów https://www.wtccc.org.uk/ccc1/ Nature 2007, Nature 2010

26 Wyniki badań Wellcome Trust Choroba afektywna dwubiegunowa locus 16p12 (OR 2,08) Choroba wieńcowa locus 9p21 ( OR het-hom 1,47-1,9) Choroba Crohna 5 znanych lokalizacji (OR het-hom ): NOD2 (1,29-1,92), IL23R (1,39- 1,86), ATG16L1 (1,19-1,85), ZNF365 (1,23-1,55), locus 5p13.1 (1,54-2,32) 4 nowe lokalizacje (OR het-hom ): IRGM (1,54-1,92), BSN (1,09- 1,84), NKX2-3 (1,2-1,62), PTPN2 (1,3-2,01)

27 Wyniki badań Wellcome Trust Nadciśnienie brak wyraźnych czynników ryzyka - kilka wariantów o stosunkowo małym wpływie (OR 0,97-1,6) Reumatoidalne zapalenie stawów 9 znanych już lokalizacji (OR 0,91-2,3) PTPN22 (OR het-hom 1,98-3,32), region MHC (OR het-hom 2,36-5,21) korelacja z chorobami serca i cukrzycą typu I

28 Cukrzyca typu I 5 znanych lokalizacji, w tym gen PTPN22 (OR het-hom 1,82-5,19) i MHC (OR het-hom 5,49-18,52) 3 nowe loci (OR het-hom ): 12q13 (1,34-1,75), 12q24 (1,34-1,94), 16p13 (1,19-1,55) Cukrzyca typu II TCFL2 (OR het-hom 1,36-1,88), FTO (OR het-hom 1,34-1,55), CDKAL1/CDKARAP1 (OR het-hom 1,18-2,17) Wyniki badań Wellcome Trust

29 Znaczenie medyczne identyfikacja grup zwiększonego ryzyka zachorowania na określone choroby związek z pojedynczym markerem, tzw. single effect sumowanie ryzyka, tzw. additive effect np. OR 1,62 (1 SNP) i OR 9,46 (5 SNPs) dla raka prostaty Pharoah et al. NEJM 2008 Zheng et al. NEJM 2008

30 funkcjonalne niefunkcjonalne markery genetyczne identyfikują obszar/gen gdzie należy szukać właściwych mutacji Zmiany zidentyfikowane w GWAS

31 Technika umożliwiająca ustalenie kolejności zasad w DNA. Sekwencjonowanie DNA

32 Sangera – 1975 rok Sangera – 1975 rok polega na terminacji łańcucha DNA przy wykorzystaniu zmodyfikowanych nukleotydów (dideoksynukleotydy) Maxama-Gilberta – 1977 rok Maxama-Gilberta – 1977 rok polega na wykorzystaniu związków chemicznych do rozszczepiania łańcucha DNA

33 automatyczne – 1987 rok automatyczne – 1987 rok oparte na metodyce Sangera http://www.answers.com/topic/dna-sequencing http://www.clontech.com/products/detail.asp?product_id=225046&tabno=2

34 3730xl DNA Analyzer 96 kapilar 96 kapilar 3 840 próbek/dobę 3 840 próbek/dobę 2 100 000 zasad/dobę 2 100 000 zasad/dobę do 900 zasad/próbkę do 900 zasad/próbkę http://www.mun.ca/biology/scarr/4241_RMC_Sequencing.html

35 pirosekwencjonowanie – 1996 rok pirosekwencjonowanie – 1996 rok sekwencjonowanie poprzez syntezę w reakcji wykorzystywane są cztery enzymy: w reakcji wykorzystywane są cztery enzymy: fragment Klenowa polimerazy DNA I fragment Klenowa polimerazy DNA I sulfurylaza ATP sulfurylaza ATP lucyferaza lucyferaza apiraza. apiraza. http://www.translational-medicine.com/content/1/1/9/figure/F5?highres=y

36 PyroMark Q96 MD do 96 próbek analizowanych jednocześnie do 96 próbek analizowanych jednocześnie max. 300 - 500 zasad/próbkę max. 300 - 500 zasad/próbkę do 960 próbek/dobę do 960 próbek/dobę krótka procedura przygotowania próbek krótka procedura przygotowania próbek

37 Sekwencjonowanie nowej generacji Analiza setek milionów lub miliardów par zasad w jednym ciągu reakcji, przy jednoczesnym obniżeniu kosztów System 454 (Roche) System 454 (Roche) HiSeq (Illumina) HiSeq (Illumina) SOLiD (Applied Biosystems) SOLiD (Applied Biosystems)

38 System 454 w oparciu o pirosekwencjonowanie w oparciu o pirosekwencjonowanie >1mln zasad/analizę >1mln zasad/analizę 1 mld zasad/dobę 1 mld zasad/dobę do 450 zasad/próbkę do 450 zasad/próbkę czułość 99% czułość 99% koszt 7 000 $/analizę koszt 7 000 $/analizę

39 HiSeq2000 w oparciu o odwracalną reakcję terminacji w oparciu o odwracalną reakcję terminacji jednoczesna analiza dwóch różnych próbek jednoczesna analiza dwóch różnych próbek 200 mld zasad/analizę, 8 dni 200 mld zasad/analizę, 8 dni do 25 mld zasad/dobę do 25 mld zasad/dobę do 100 zasad/próbkę do 100 zasad/próbkę czułość >99% czułość >99% koszt 10 000 $/analizę koszt 10 000 $/analizę

40 5500xl SOLiD System w oparciu o ligację komplementarnych frag. w oparciu o ligację komplementarnych frag. jednoczesna analiza 12 różnych próbek jednoczesna analiza 12 różnych próbek 300 mld zasad/analizę, 7 dni 300 mld zasad/analizę, 7 dni do 45 mld zasad/dobę do 45 mld zasad/dobę do 75 zasad/próbkę do 75 zasad/próbkę czułość 99.99% czułość 99.99% koszt 6 000 $/analizę koszt 6 000 $/analizę

41 Postęp w sekwencjonowaniu

42 Podsumowanie najlepsze efekty daje połączenie kilku metod konieczne nowej jakości badania strukturalne i asocjacyjne : RNA białek innych oddziaływań ze środowiskiem o nieznanym dotąd charakterze

43


Pobierz ppt "Współczesne metody analiz genetycznych Katedra Onkologii Zakład Genetyki i Patomorfologii PUM Anna Jakubowska."

Podobne prezentacje


Reklamy Google