Pobieranie prezentacji. Proszę czekać

Pobieranie prezentacji. Proszę czekać

Współczesne metody analiz genetycznych Katedra Onkologii Zakład Genetyki i Patomorfologii PUM Anna Jakubowska.

Podobne prezentacje


Prezentacja na temat: "Współczesne metody analiz genetycznych Katedra Onkologii Zakład Genetyki i Patomorfologii PUM Anna Jakubowska."— Zapis prezentacji:

1 Współczesne metody analiz genetycznych Katedra Onkologii Zakład Genetyki i Patomorfologii PUM Anna Jakubowska

2 Genom Chromosom Gen Region międzygenowy

3 rozpoczęcie HGP – 1990 (Human Genome Project) wstępny opis sekwencji – 2000 (Venter et al., Science 2001; Lander et al., Nature 2001) zakończenie sekwencjonowania – 2003 oficjalne zakończenie HGP – 2004 (International Human Genome Sequencing Consortium, Nature 2004 ) Poznanie genomu człowieka

4 pz ~ 2% to sekwencje kodujące genów kodujących białka genów kodujących RNA pseudogenów ~ 98% to sekwencje niekodujące introny oraz sekwencje międzygenowe SNPs (polimorfizmy pojedynczego nukleotydu) ~ regionów CNV (duplikacje lub delecje odcinków DNA o długości >500 zasad) Struktura genomu człowieka (http://www.ensembl.org/Homo_sapiens/Info/StatsTable)

5 Geny funkcja wielu genów wciąż niepoznana identyfikacja genów lub specyficznych stref genetycznych związanych z rozwojem chorób: badania asocjacyjne sekwencjonowanie genomu

6 analiza wybranych markerów – kandydatów analiza markerów pokrywających cały genom, tzw. GWAS (Genome – Wide Association Study) potocznie nazywana skanowaniem genomu Badania asocjacyjne

7 GWAS Badanie przypadek - kontrola (case - control), w którym analizuje się związek pomiędzy występowaniem określonej cechy klinicznej a SNPs lub CNVs rozmieszczonymi w całym genomie AB C AC ABCBB SNP CNV

8 Założenia GWAS badanie dużej liczby polimorfizmów o największej zmienności międzyosobniczej badanie jak największej grupy osób chorych i zdrowych

9 Chorzy Zdrowi DNA Porównanie Identyfikacja SNP związanych z chorobą

10 Badania GWAS – kluczowe zasady homogenność grupy badanej pod względem analizowanej cechy liczna grupa kontrolna oraz badana walidacja

11 Etapy GWAS Garcia-Closas M, Chanock S Clin Cancer Res 2008;14: ©2008 by American Association for Cancer Research Przypadki i kontrole Badane SNPs I etap II etap III etap Mapowanie zmian Analiza funkcjonalna

12 Polimorfizmy dla GWAS wysoka częstość, MAF (minor allele frequency) >5% ~7 mln SNP o częstości MAF >5% ~4 mln SNP o częstości 1-5% brak sprzężenia SNP nie powinny znajdować się w genomie blisko siebie w tzw. nierównowadze sprzężeń (linkage disequilibrium) wykorzystanie mikromacierzy Affymetrix Illumina

13 Projekt HapMap międzynarodowe przedsięwzięcie obejmujące Japonię, Kanadę, Chiny, Nigerię i USA w celu identyfikacji oraz określenia częstości zmian polimorficznych w genomie ludzkim w różnych populacjach 270 osób: 90 z Nigerii 45 z Japonii 45 z Chin 90 z Europy północnej i zachodniej

14 Analiza mikromacierzy wytworzenie mikromacierzy naniesienie na płytkę gotowych lub zsyntetyzowanych in situ sond długości nukleotydów Sonda oligonukleotydowa mikromacierz

15 Analiza mikromacierzy hybrydyzacja DNA na płytce zawierającej sondy

16 Analiza mikromacierzy skanowanie

17 Analiza mikromacierzy analiza ilościowa

18 Analiza mikromacierzy Affymetrix Illumina

19 Affymetrix chip Affymetrix's Genome-Wide Human SNP Array 6.0 zawiera sondy dla SNP i CNV strategia wyboru SNP: tylko połowa w oparciu o projekt HapMap, tzw. haplotype - tagging tagSNPs, reszta to dowolne SNPs występujące w genomie sondy 25-nukleotydowe, 4-6 kopii/zmianę detekcja hybrydyzacja wyznakowanego DNA

20 Trawienie enzymami restrykcyjnymi Ligacja z adapterem Nsp lub Sty Amplifikacja PCR z jednym starterem Oczyszczenie próbki Fragmentacja, znakowanie końców Hybrydyzacja

21 Illumina chip HumanOmni2.5-Quad BeadChip zawiera > 2.45 milliona sond do badania SNPs i CNVs strategia wyboru SNPs: w oparciu o projekt HapMap, tzw. haplotype - tagging tagSNPs sondy 50-nukleotydowe, 1/zmianę detekcja wydłużanie sond z dobudowaniem znakowanych nukleotydów

22 Genomowe DNA ( ng) Amplifikacja DNA Fragmentacja DNA Hybrydyzacja DNA z sondą Wydłużanie sond z dobudowaniem wyznakowanych nukleotydów 2-etapowa detekcja Etap I Etap II

23 Zestawienie wykonanych GWAS ~ 600 GWAS obejmujących różne grupy i populacje 150 różnych zespołów np. cukrzyca typu I i II, choroba Crohna, choroba Alzheimera, schizofrenia, udar, choroby serca, nowotwory złośliwe, otyłość > SNP wyselekcjonowanych do walidacji zidentyfikowano ~800 SNP związanych z chorobami (p<5×10 -8 ) Johnson and O'Donnell, BMC Medical Genetics 2009 Manolio, NEJM 2010

24 Manolio et al., NEJM 2010

25 Badanie Wellcome Trust ważnych schorzeń wieloczynnikowych osób (chorych i zdrowych) polimorfizmów (SNPs i CNVs) 200 badaczy, 9 milionów funtów https://www.wtccc.org.uk/ccc1/ Nature 2007, Nature 2010

26 Wyniki badań Wellcome Trust Choroba afektywna dwubiegunowa locus 16p12 (OR 2,08) Choroba wieńcowa locus 9p21 ( OR het-hom 1,47-1,9) Choroba Crohna 5 znanych lokalizacji (OR het-hom ): NOD2 (1,29-1,92), IL23R (1,39- 1,86), ATG16L1 (1,19-1,85), ZNF365 (1,23-1,55), locus 5p13.1 (1,54-2,32) 4 nowe lokalizacje (OR het-hom ): IRGM (1,54-1,92), BSN (1,09- 1,84), NKX2-3 (1,2-1,62), PTPN2 (1,3-2,01)

27 Wyniki badań Wellcome Trust Nadciśnienie brak wyraźnych czynników ryzyka - kilka wariantów o stosunkowo małym wpływie (OR 0,97-1,6) Reumatoidalne zapalenie stawów 9 znanych już lokalizacji (OR 0,91-2,3) PTPN22 (OR het-hom 1,98-3,32), region MHC (OR het-hom 2,36-5,21) korelacja z chorobami serca i cukrzycą typu I

28 Cukrzyca typu I 5 znanych lokalizacji, w tym gen PTPN22 (OR het-hom 1,82-5,19) i MHC (OR het-hom 5,49-18,52) 3 nowe loci (OR het-hom ): 12q13 (1,34-1,75), 12q24 (1,34-1,94), 16p13 (1,19-1,55) Cukrzyca typu II TCFL2 (OR het-hom 1,36-1,88), FTO (OR het-hom 1,34-1,55), CDKAL1/CDKARAP1 (OR het-hom 1,18-2,17) Wyniki badań Wellcome Trust

29 Znaczenie medyczne identyfikacja grup zwiększonego ryzyka zachorowania na określone choroby związek z pojedynczym markerem, tzw. single effect sumowanie ryzyka, tzw. additive effect np. OR 1,62 (1 SNP) i OR 9,46 (5 SNPs) dla raka prostaty Pharoah et al. NEJM 2008 Zheng et al. NEJM 2008

30 funkcjonalne niefunkcjonalne markery genetyczne identyfikują obszar/gen gdzie należy szukać właściwych mutacji Zmiany zidentyfikowane w GWAS

31 Technika umożliwiająca ustalenie kolejności zasad w DNA. Sekwencjonowanie DNA

32 Sangera – 1975 rok Sangera – 1975 rok polega na terminacji łańcucha DNA przy wykorzystaniu zmodyfikowanych nukleotydów (dideoksynukleotydy) Maxama-Gilberta – 1977 rok Maxama-Gilberta – 1977 rok polega na wykorzystaniu związków chemicznych do rozszczepiania łańcucha DNA

33 automatyczne – 1987 rok automatyczne – 1987 rok oparte na metodyce Sangera

34 3730xl DNA Analyzer 96 kapilar 96 kapilar próbek/dobę próbek/dobę zasad/dobę zasad/dobę do 900 zasad/próbkę do 900 zasad/próbkę

35 pirosekwencjonowanie – 1996 rok pirosekwencjonowanie – 1996 rok sekwencjonowanie poprzez syntezę w reakcji wykorzystywane są cztery enzymy: w reakcji wykorzystywane są cztery enzymy: fragment Klenowa polimerazy DNA I fragment Klenowa polimerazy DNA I sulfurylaza ATP sulfurylaza ATP lucyferaza lucyferaza apiraza. apiraza.

36 PyroMark Q96 MD do 96 próbek analizowanych jednocześnie do 96 próbek analizowanych jednocześnie max zasad/próbkę max zasad/próbkę do 960 próbek/dobę do 960 próbek/dobę krótka procedura przygotowania próbek krótka procedura przygotowania próbek

37 Sekwencjonowanie nowej generacji Analiza setek milionów lub miliardów par zasad w jednym ciągu reakcji, przy jednoczesnym obniżeniu kosztów System 454 (Roche) System 454 (Roche) HiSeq (Illumina) HiSeq (Illumina) SOLiD (Applied Biosystems) SOLiD (Applied Biosystems)

38 System 454 w oparciu o pirosekwencjonowanie w oparciu o pirosekwencjonowanie >1mln zasad/analizę >1mln zasad/analizę 1 mld zasad/dobę 1 mld zasad/dobę do 450 zasad/próbkę do 450 zasad/próbkę czułość 99% czułość 99% koszt $/analizę koszt $/analizę

39 HiSeq2000 w oparciu o odwracalną reakcję terminacji w oparciu o odwracalną reakcję terminacji jednoczesna analiza dwóch różnych próbek jednoczesna analiza dwóch różnych próbek 200 mld zasad/analizę, 8 dni 200 mld zasad/analizę, 8 dni do 25 mld zasad/dobę do 25 mld zasad/dobę do 100 zasad/próbkę do 100 zasad/próbkę czułość >99% czułość >99% koszt $/analizę koszt $/analizę

40 5500xl SOLiD System w oparciu o ligację komplementarnych frag. w oparciu o ligację komplementarnych frag. jednoczesna analiza 12 różnych próbek jednoczesna analiza 12 różnych próbek 300 mld zasad/analizę, 7 dni 300 mld zasad/analizę, 7 dni do 45 mld zasad/dobę do 45 mld zasad/dobę do 75 zasad/próbkę do 75 zasad/próbkę czułość 99.99% czułość 99.99% koszt $/analizę koszt $/analizę

41 Postęp w sekwencjonowaniu

42 Podsumowanie najlepsze efekty daje połączenie kilku metod konieczne nowej jakości badania strukturalne i asocjacyjne : RNA białek innych oddziaływań ze środowiskiem o nieznanym dotąd charakterze

43


Pobierz ppt "Współczesne metody analiz genetycznych Katedra Onkologii Zakład Genetyki i Patomorfologii PUM Anna Jakubowska."

Podobne prezentacje


Reklamy Google