Pobierz prezentację
Pobieranie prezentacji. Proszę czekać
OpublikowałEliasz Seweryn Został zmieniony 10 lat temu
1
Aktualne metody typowania tkankowego, zgodność pary dawca biorca
Jacek Nowak Zakład Immunogenetyki, Instytut Hematologii i Transfuzjologii, Warszawa Konferencja POLTRANSPLANT: „Szkolenie osób, których czynności bezpośrednio wpływają na jakość komórek krwiotwórczych, a także na bezpieczeństwo dawców i biorców”. Warszawa, Hotel Sobieski, 8-9 grudnia 2011 r.
2
Metody genotypowania HLA
Testy HLA Rozdzielczość Niska Pośrednia Wysoka PCR-SSP PCR-SSOP PCR-SSOP Luminex PCR-SSOP Luminex HD PCR-RSCA PCR-SBT (met. Sangera) PCR-SBT (pyrosekwencjonowanie)
3
Porównanie metod SSP i SSOP
Izolacja DNA Amplifikacja DNA swoista wiele par primerów krótkie fragmenty (primery flankują krótkie miejsca polimorficzne exonu) Elektroforeza wielu produktów PCR Odczyt Analiza komputerowa konstelacji dodatnich PCR Interpretacja immunogenetyczna SSOP Izolacja DNA Amplifikacja DNA nieswoista jedna para primerów długi fragment (primery flankują cały exon) Hybrydyzacja swoista (wiele swoistych sond na pasku nitrocelulozy) Barwienie produktów hybrydyzacji, odczyt Analiza komputerowa konstelacji dodatnich sond Interpretacja immunogenetyczna
4
PCR SSP 1. Przygotowanie mieszaniny reakcyjnej PCR - DNA
- Taq polimeraza - dNTPy - Bufor, Mg2+ 2. Przeniesienie do wielu probówek reakcyjnych o różnej swoistości - swoiste primery
5
PCR SSP 3. Reakcja PCR - wiele amplifikacji swoistych
- denaturacja - renaturacja (hybrydyzacja) - elongacja 3. Przeniesienie na żel agarozowy (ważne pozycjonowanie dołków).
6
PCR SSP 5. elektroforeza 6. transiluminator
7
PCR SSP 7. Zdjęcie i analiza wzoru prążków (archiwizacja)
8
PCR SSP 7. Analiza wzoru prążków
9
PCR SSO
10
PCR SSO - wzór prążków
11
RSCA, (Reference strand conformation analysis) Analiza konformacji referencyjnej nici DNA
12
SBT (met. Sangera) Izolacja DNA Amplifikacja 1 (swoista dla exonu)
Klasa I – exony 2 i 3 Klasa II – exon 2 Dodatkowe exony (4,5,6,7) Oczyszczanie Amplifikacja 2 (nested PCR) wraz terminacją znakowanymi nukleotydami kończącymi Elektroforeza kapilarna Detekcja laserowa i określenie sekwencji nukleotydów Analiza porównawcza bibliotek sekwencji alleli HLA
13
SBT, (Sequence-based typing) Sekwencjonowanie
14
SBT, (Sequence-based typing) Sekwencjonowanie
15
Pyrosekwencjonowanie polega na syntezie kolejnych nukleotydów i detekcji wydzielanego PPi
16
Stopniowe rozszerzanie typowania HLA
1. Wstępne typowanie chorego A, B, DRB1 l.r. (dobór rodzinny, skierowanie na poszukiwanie dawcy niespokrewnionego 2. Wstępne typowanie dawców do rejestru (j.w.) 3. Typowanie potwierdzające w doborze rodzinnym - A, C, DRB1(ew. DQB1) l.r. 4. Typowanie uzupełniające dawców - Wybrane locus l.r./H.R., kilku dawców jednocześnie 5. Typowanie potwierdzające w doborze dawcy niespokrewnionego - C i DQB1 l.r. oraz A, B, C, DRB1 i DQB1 H.R.
17
Czynniki wpływające na wynik przeszczepu
} HLA rozpoznanie faza choroby dawka komórek CD34+ status CMV i inne herpeswirusy płeć wiek chorego/dawcy grupa krwi AB0 wiek dawcy mHA polimorfizm KIR i cytokin Kumulatywny wpływ na wynik przeszczepienia
18
Prawdopodobieństwo przeżycia chorych w zależności od liczby niezgodnych alleli lub antygenów HLA-A, B, C, DRB1 i DQB1 wyznaczane metodą Kaplana-Meiera. Według 13-th International Histocompatibility Working Group in Hematopoietic Cell Transplantation.
19
[C*-B*-DRB1*] jest centralną częścią haplotypu HLA
Tabela 4.4. Śmiertelność całkowita pacjentów po transplantacji krwiotwórczych komórek macierzystych. Proporcja ryzyka (hazard ratio) w regresyjnym modelu wielu zmiennych w zależności od niezgodnego locus. Analizę ograniczono do par z pojedynczą niezgodnością. Według 13-th International Histocompatibility Working Group in Hematopoietic Cell Transplantation. [C*-B*-DRB1*] jest centralną częścią haplotypu HLA
20
Niezgodność allelu lub antygenu klasy I vs
Niezgodność allelu lub antygenu klasy I vs. zgodność (Przewlekła choroba GvH) ...ale w analizie wieloczynnikowej (multivariate analysis), niezgodność allelu HLA klasy I nie miała istotnego wpływu na OS (P=0.18). Greinix HT et al. (2005) Bone Marrow Transplantation 35, 57–62
21
Źródła przeszczepu komórek krwiotwórczych
Dawca klasyczny rodzeństwo Dawcy alternatywni dawcy niespokrewnieni zgodni ( ) krew pępowinowa prawie zawsze niezgodna ( ) niespokrewnieni częściowo niezgodni pozostali członkowie rodziny i haploidentyczni Preferujemy poszukiwanie najlepszego możliwego dawcy we wszystkich dostępnych źródłach.
22
Kryteria doboru dawcy rodzinnego spośród rodzeństwa
Pełna zgodność w 4 (5) loci na poziomie niskiej rozdzielczości A, B, Cw, DRB1, (DQB1) Rzadko możliwa jest optymalizacja doboru dawcy rodzinnego (płeć, CMV, grupa krwi) - jeśli jest więcej niż 1 potencjalny dawca
23
Dawca rodzinny spośród rodzeństwa
Cel typowania HLA: 1. Wykazanie, że dawca odziedziczył te same haplotypy HLA co chory 2. Wykluczenie zjawiska crossing over
24
Dziedziczą się całe haplotypy HLA, tworząc genotypy
A*0101 Cw*0701 B* DRB1*0301 DQB1*0201 a ojciec b A*2402 Cw*0702 B* DRB1*1501 DQB1*0602 A*0301 Cw*0702 B* DRB1*1501 DQB1*0602 c matka d A*2501 Cw*1203 B* DRB1*1301 DQB1*0603 A*0101 Cw*0701 B* DRB1*0301 DQB1*0201 a pacjent d A*2501 Cw*1203 B* DRB1*1301 DQB1*0603 rodzeństwo a/c a/d b/c b/d
25
Rekombinacja w obszarze MHC (1%) = nowy haplotyp/genotyp
A*0101 Cw*0701 B* DRB1*0301 DQB1*0201 a ojciec b A*2402 Cw*0702 B* DRB1*1501 DQB1*0602 A*0301 Cw*0702 B* DRB1*1501 DQB1*0602 c matka d A*2501 Cw*1203 B* DRB1*1301 DQB1*0603 A*0101 Cw*0701 B* DRB1*0301 DQB1*0201 a pacjent d+c A*2501 Cw*1203 B* DRB1*1501 DQB1*0602
26
Obliczanie szansy znalezienia przynajmniej jednego zgodnego dawcy w zależności od liczby rodzeństwa 0.25 = prawdopodobieństwo przy 1 osobie, n = liczba osób P = 1 - (1 – 0.25)n
27
Wynik rodzinnego typowania HLA musi być zgodny z zasadami dziedziczenia.
Allele wszystkich loci pochodzą od biologicznych rodziców, po jednym od każdego z nich; Tylko 4 haplotypy w rodzinie; Możliwa jest rekombinacja (crossing over), ale rzadko; Nie można dziedziczyć dwóch haplotypów od jednego rodzica, ale rodzic może być zgodny z dzieckiem (rzadko) Podwójna rekombinacja praktycznie nie występuje, itp…
28
Szansa na pełną zgodność HLA pomiędzy rodzicem a dzieckiem (np
Szansa na pełną zgodność HLA pomiędzy rodzicem a dzieckiem (np. jeśli oboje rodzice dziedziczą taki sam haplotyp) 1-3% Optymalizacja - 1 haplotyp wspólny
29
Wstępne badanie HLA w najbliższej rodzinie chorego
Zakres: A,B,DRB1; n.r.
30
Wstępne badanie HLA w najbliższej rodzinie chorego
Zakres: A,B,DRB1; n.r. Potwierdzające badanie HLA chorego i zgodnego członka rodziny (1 lub więcej) Zakres: A,B,C,DRB1,(DQB1); n.r. Nowe próbki
31
Brak dawcy rodzinnego
32
Dawcy niespokrewnieni a rodzinni
Częstości skumulowane (A) całkowitego przeżycia, (B) przeżycia wolnego od choroby, (C) śmiertelności związanej z przeszczepieniem, (D) GVHD stopnia II do IV, (E) wznowy, i (F) GVHD stopnia III do IV u 236 pacjentów, zależnie od typu dawcy Yakoub-Agha, I. et al. J Clin Oncol 2006; 24: Copyright © American Society of Clinical Oncology
33
Kryteria doboru dawcy niespokrewnionego
Pełna zgodność w 5 loci A, B, Cw, DRB1, DQB1 na poziomie alleli Optymalizacja 1. Poprawa rozdzielczości typowania HLA 2. Poprawa przygotowania i leczenia powikłań potransplantacyjnych u pacjenta
34
1. dawca z Niemiec Etap CT: DKM zgłosił astmę oskrzelową.
35
2. dawca z Kanady: Etap CT: CAUB Niezgodność 1 allelu w locus B; Fenotypowo zgodny w 10/10 alleli
36
2. dawca z Kanady: Etap CT: CAUB Niezgodność 1 allelu w locus B; Fenotypowo zgodny w 10/10 alleli
37
2. dawca z Kanady: Etap CT: CAUB Niezgodność 1 allelu w locus B; Fenotypowo zgodny w 10/10 alleli
38
Błędne typowanie pacjenta Pacjent B. J
Błędne typowanie pacjenta Pacjent B.J. Wykryto błędne typowanie w locus A. Dobrano zgodnego dawcę krajowego.
39
Błędne typowanie pacjenta Pacjent B. J
Błędne typowanie pacjenta Pacjent B.J. Wykryto błędne typowanie w locus A. Dobrano zgodnego dawcę krajowego.
40
Błędne typowanie pacjenta Pacjent B. J
Błędne typowanie pacjenta Pacjent B.J. Wykryto błędne typowanie w locus A. Dobrano zgodnego dawcę krajowego.
41
Błędne typowanie pacjenta Pacjent B. J
Błędne typowanie pacjenta Pacjent B.J. Wykryto błędne typowanie w locus A. Dobrano zgodnego dawcę krajowego.
42
Błędne typowanie pacjenta Pacjent B. J
Błędne typowanie pacjenta Pacjent B.J. Wykryto błędne typowanie w locus A. Dobrano zgodnego dawcę krajowego.
43
Błędne typowanie pacjenta prowadzi do:
fałszywej oceny szansy na znalezienie dawcy, błędny kierunek poszukiwań, opóźnienie.
44
Błędne typowanie pacjenta Pacjent S. T
Błędne typowanie pacjenta Pacjent S.T. Wykryto błąd typowania w dwóch loci (A, DRB1). Dobrano dwóch rodzinnych dawców.
45
Błędne typowanie pacjenta Pacjent S. T
Błędne typowanie pacjenta Pacjent S.T. Wykryto błąd typowania w dwóch loci (A, DRB1). Dobrano dwóch rodzinnych dawców.
46
Pokrewieństwo małżeństw Dziedziczenie dwóch identycznych haplotypów przez obustronnego kuzyna i pacjentkę V.B. a,c a,f b,d b,h f,b a,b f,h Pacjentka V.B. Zgodny kuzyn P.B. b,g d,h a,e c,f Rodzice pacjentki Rodzeństwo rodziców pacjentki Badanie HLA u wszystkich obustronnych kuzynów chorej Haplotypy pacjentki: a - A*02-B*49-Cw*07-DRB1*0401-DQB1*0302 b - A*25-B*18-Cw*12-DRB1*1501-DQB1*0602
47
Dobór NDSz w zakresie ligandów KIR
48
Struktura cząsteczki HLA klasy I
α-helix, ARS - Antigen Recognition Site α1 Rowek, β-pofałdowana kartka Prezentowany peptyd α2 Struktura cząsteczki HLA wiążąca peptyd i TCR lub KIR jest to łańcuch polipeptydowy. Tworzy on rowek składający się z dna rowka (β-pofałdowana kartka) i jego brzegów (α-helix). Różnica (substytucja) aminokwasów tworzących rowek jest podstawą niezgodności HLA. β2-mikroglobulina α3 Histocheck, in: Elsner et al. Bone Marrow Transplantation (2004) 33, 165–169
50
Typ KIR jest wiązany przez supertypową grupę antygenów HLA
Niezgodność TCR-MHC Brak niezgodności KIR 1. Mary Carrington, et al. The KIR Gene Cluster. 2003:National Library of Medicine NCBI, Bethesda MD, USA.
51
Typ KIR jest wiązany przez supertypową grupę antygenów HLA
Niezgodność TCR-MHC oraz niezgodność KIR 1. Mary Carrington, et al. The KIR Gene Cluster. 2003:National Library of Medicine NCBI, Bethesda MD, USA.
52
Potencjalne znaczenie ligandów KIR w HSCT
Niezgodność ligandów KIR w kierunku GvH Korzystny efekt GvL1) szczególnie w białaczce szpikowej3) z tylko nieznacznym efektem GvH1) immunoablacja2) 1) Ruggieri L, et al. 1999, Blood 94, 333-9 2) Ruggieri L, et al. 2000, Blood 96, 473a 3) Giebel S, et al. 2003, Blood 102, 814-9
53
Korzystny wpływ niezgodności ligandów KIR (OS i DFS) Kierunek GvH, pacjenci CML, leczenie ATG
Giebel S, Locatelli FW, Lamparelli T, et al. Survival advantage with KIR ligand incompatibility in hematopoietic stem cell transplantation from unrelated donors. Blood. 2003;102:
54
Selekcja dawców w zakresie ligandów KIR
1. Jakie są dozwolone KIR u dawcy? 2. Czy HLA biorcy je zahamują? Ad 1: KIR dawcy (kierunek GvH) - KIR2DL2/3 Ad 2: Czy biorca je zahamuje? - TAK Wniosek: Nie ma niezgodności KIR
55
Selekcja dawców w zakresie ligandów KIR
1. Jakie są dozwolone KIR u dawcy? 2. Czy HLA biorcy je zahamują? Ad 1: KIR dawcy (kierunek GvH) - KIR2DL1; 2DL2/3 Ad 2: Czy biorca je zahamuje? - NIE Wniosek: Wystąpiła niezgodność KIR
56
KIR Ligand Calculator (Zgodni) http://www. ebi. ac. uk/ipd/kir/ligand
•Robinson J, Mistry K, McWilliam H, Lopez R, Marsh SGE. IPD - the Immuno Polymorphism Database Nucleic Acids Research (2010), 38: D863-9
57
KIR Ligand Calculator (Niezgodność GvH = GvL) http://www. ebi. ac
Chory:B.Ł. dgn. AML •Robinson J, Mistry K, McWilliam H, Lopez R, Marsh SGE. IPD - the Immuno Polymorphism Database Nucleic Acids Research (2010), 38: D863-9
58
OS, DFS, wznowa związana z przeszczepieniem
Bornhauser, M. et al. Blood 2004;103: Copyright ©2004 American Society of Hematology.
59
Potencjalny wpływ niezgodności ligandów KIR w HSCT
Dobór dawcy KK niezgodnego w zakresie ligacji KIR MOŻE BYĆ KORZYSTNY KLINICZNIE. Współistnienie niezgodności dwóch typów (NK i T-komórkowej) na tej samej cząsteczce HLA: 1. Utrudnia wykazanie korzystnego wpływu niezgodności ligandów KIR 2. Utrudnia selekcję dawców z wybiórczą niezgodnością KIR
60
Tylko w przypadku wystąpienia więcej niż 1 potencjalnego dawcy komórek krwiotwórczych (ABDR) można rozważać dalszą selekcję optymalnego dawcy: Polimorfizm immunogenetyczny 1. KIR 2. HLA-DPB1 3. mHag 4. Polimorfizm limfokin, chemokin, receptorów (NOD2/CARD15, IL6, IL10, TNF, IFNG, CCR5, SDF-1/CXCL12 i inne) Cechy biologiczne: 1. Status CMV 2. Płeć 3.Wiek 4. Grupa krwi AB0 5. Pochodzenie etniczne
61
Dane pacjenta powinny być znane przed selekcją dawcy
Cechy biologiczne Dane pacjenta powinny być znane przed selekcją dawcy 1. Status CMV - Zgodność statusu 2. Płeć - Dawcy płci męskiej - lepsi 3. Immunizacja, - Liczba ciąż, Liczba przetoczeń 4. Wiek, - Młodsi dawcy - lepsi 5. Pochodzenie etniczne
62
Czy uwzględniać DPB1 ? 6p21.31 38.4%1)
A Cw B TNF LTA DRB1 DQB1 DPB1 13.2%2) 38.4%1) Procedury zakończone doborem 10/10 alleli3) - IHiT ,3% - DCTK - 69,7% RR=1.77; P=0.0061 - Medigen - 60,4% RR=2.66; P=0, - CSK WUM 74,4% RR=1.40 ; NS 1. Tiercy et al. Bone Marrow Transplant 2000, 26(4), 2. Hurley et al. Bone Marrow Transplant 2000, 25(4), 3. Żalikowska-Hołoweńko. Poltransplant, Biuletyn Informacyjny
63
Czy uwzględniać DPB1 ? Zgodność na poziomie alleli? - raczej nie
Zgodność w zakresie grup T-cell epitop (TCE)? HLA-DP niezgodne 10/10, N=2705; Shaw, Tissue Antigens 2007
64
Grupy DPB1 w zakresie TCE (T-cell epitop) 3 i 4
65
Czy uwzględniać DPB1 ? Zgodność DPB1 pomiędzy dawcą a biorcą komórek krwiotwórczych MOŻE MIEĆ ZNACZENIE KLINICZNE. Uzasadnione są dalsze badania, zwłaszcza nad wyjaśnieniem mechanizmu immunologicznego.
66
Algorytm poszukiwania niespokrewnionego dawcy przedstawiony przez POLTRANSPLANT ma braki
Nie uwzględniono etapu “further typing”, który zmniejsza koszty i przyśpiesza dobór Nie uwzględniono jednoczesnego badania większej liczby dawców bez sprowadzania ich próbek Nie uwzględniono zakresu informacji dodatkowych koniecznych do uzyskania na etapie typowania potwierdzającego dawcy (CMV, inne IDM, liczba przetoczeń i ciąż, grupa krwi, wywiad lekarski, przynależność etniczna, płeć, wiek itp.).
67
Wnioski Genotypowania HLA przy użyciu różnych metod o poziomie rozdzielczości odpowiednim do sytuacji znajduje zastosowanie w procedurach doboru dawców komórek krwiotwórczych. Zgodność HLA 10/10 pomiędzy dawcą a biorcą KK stanowi podstawowy warunek skutecznego leczenia transplantacyjnego. Dobór HLA-DPB1 może pozwolić na poprawę przeżywalności chorych, lecz również zwiększyć odsetek wznowy. Wymaga dalszych badań. Korzystna niezgodność ligacji KIR zawsze wiąże się z niezgodnością T-komórkową. Wymaga istotnych modyfikacji przygotowania immunosupresyjnego pacjenta.
Podobne prezentacje
© 2024 SlidePlayer.pl Inc.
All rights reserved.