Białko CD9 jako czynnik niezbędny dla procesu zapłodnienia Requirement of CD9 on the Egg Plasma Membrane for Fertilisation. Kenji Miyado i wsp., Science, 14.01.2000

CD9: występujące m.in. w błonie plazmatycznej oocytu i plemnika integralne, transbłonowe białko występujące m.in. w błonie plazmatycznej oocytu i plemnika należy do rodziny białek TM4 (tetraspan-membrane proteins) adhezja komórek ruchliwość metastaza komórek nowotworowych

CD9 może oddziaływać z integrynami takimi jak α6β1 lub α3β1. Przypuszcza się, że CD9 może być kofaktorem dla integryn. Rys.2 Model roli białka CD9 w oddziaływaniu z integryną α6β1 lub α3β1 ( wg Chena i wsp. 1999).

Dysrupcja genu CD9: brak wpływu białka CD9 na Rys3. Obraz cytometrii przepływowej dla komórek szpiku kostnego z zastosowaniem przeciwciał anty-CD9 Myszy CD9-/- były ‘produkowane’ przez dysrupcję genu CD9 w komórkach ES. Obraz cytometrii przepływowej pokazuje brak ekspresji CD9 w kom. szpiku kostnego (komórki somatyczne), co oznacza, że obecność białka CD9 nie jest konieczna do prawidłowego rozwoju komórek myszy okresie płodowym ani później. Myszy CD9 -/- prawidłowy rozwój płodowy prawidłowy wzrost i dojrzewanie brak wpływu białka CD9 na adhezję lub wzrost komórek

Rys4. Płodność myszy CD9+/+, CD9+/-, CD9-/- (w nawiasach: liczby kopulujących par) Płodność myszy: w klatkach umieszczano razem 1 samca i 1-2samice i kojarzono jak powyżej. Dla samic CD-/- liczba potomstwa była mniejsza niż 2% w odniesieniu do średnich wartości potomstwa urodzonego przez szczep dziki lub samice heterozygotyczne. Wnioski: samice CD9-/- są bezpłodne samce CD9-/- wykazują normalną płodność, jeżeli są kojarzone z samicami o dzikim fenotypie

Samice CD9-/-: brak morfologicznych nieprawidłowości w budowie jajników obecne wszystkie stadia wzrostu i dojrzewania oocytu prawidłowo wykształcone po owulacji ciałko żółte owulacja u samic pobudzonych hormonalnie przebiega prawidłowo (liczby owulowanych przez mysz oocytów: CD9-/- 19±1,9; CD9+/+ 22 ±3,0) pierwsze ciałko kierunkowe obserwowane u 97% oocytów CD9-/- (13h po podaniu hCG; patrz zdjęcie) oocyty zatrzymane w metafazie II Wniosek: bezpłodność u samic CD9-/- nie jest powodowana nieprawidłową owulacją lub zaburzeniami w procesie dojrzewania oocytu

6h inseminacji z plemnikami CD9+/+ Zapłodnienie in vitro Oocyty CD9+/+ Oocyty CD9-/- 6h inseminacji z plemnikami CD9+/+ Penetracja osłonki przejrzystej przez plemniki brak fuzji z plemnikiem (96%) utworzenie przedjądrzy nie zachodzi brak bloku przeciw polispermii, gromadzenie plemników pod osłonką przejrzystą (powyżej 5 plemników 65% przypadków) Penetracja osłonki przejrzystej przez plemniki 57% fuzja z plemnikiem utworzenie przedjądrzy wyrzucenie ziaren korowych, blok przeciwko polispermii na poziomie osłonki przejrzystej

Całkowita liczba oocytów (%) Penetracja osłonki przejrzystej (%) CD9+/+ CD9-/- Całkowita liczba oocytów (%) Brak zapłodnienia (%) Zapłodnienie Zdegenerowało Penetracja osłonki przejrzystej (%) Przedjądrza CD9+/+ 179 (100) 69 (39) 0 (0) 102 (57) 8 (4) CD9-/- 154 (100) 40 (26) 100 (65) 1 (0.6) 13 (8) Rys6. Oocyty biorące udział w doświadczeniu badającym przebieg zapłodnienia in vitro, osłonki nie naruszone (13-15h po podaniu hCG) Tab1. Zestawienie otrzymanych danych z powyższego doświadczenia

CD9+/+ CD9-/- Czas po zaplemnieniu (h) Całkowia liczba oocytów Liczba plemników po fuzji z oocytem (%) Liczba plemników/ oocyt 1 2 3 4 CD9+/+ 53 38 51 9 1,68 CD9-/- 56 96 0,04 6 26 11 62 2,19 19 79 21 0,21 W doświadczeniu użyto oocytów pozdawionych osłonki przejrzystej by zbadać zdolność błony plazmatycznej oocytu CD9-/- do wiązania się z plemnikiem (w takich warunkach plemnik może bezpośrednio oddziaływać z powierzchnią oocytu) Wyniki: - brak różnic w wiązaniu plemników na powierzchni oocytów CD9+/+ i CD9-/- -! drastycznie obniżona fuzja oocytu CD9-/- z plemnikiem Wniosek: CD9 odgrywa ważną rolę przy fuzjowaniu komórki jajowej z plemnikiem Rys7. Oocyty biorące udział w doświadczeniu badającym przebieg zapłodnienia in vitro, zdjęte osłonki przejrzyste Tab2. Zestawienie otrzymanych danych z powyższego doświadczenia

RysA. Obraz elektroforezy ilustrujący ekspresję białka CD9 F9 to szczep embrionalnych komórek rakowych myszy. CD9 występujące zwiazane z powierzchnią oocytu jest bardzo podobne do CD9 wyst. w błonie komórek F9. Barwienie immunofluorescencyjne pokazuje, że białko CD9 występuje na powierzchni błony oocytu (nitegralne białko oolemmy) RysB. Lokalizacja CD9 na powierzchni błony oocytu (met. immunofluoresc.)

Oocyty CD9-/- obniżona ilość zapłodnień in vitro zdrowe potomstwo samic CD-/- in vivo CD9 jest istotne dla interakcji plemnik-komórka jajowa NIE WPŁYWA NA PÓŹNIEJSZY ROZWÓJ ZYGOTY

Tab1. Rozwój oocytów CD9-/- po bezpośrednim wstrzyknięciu plemnika (wild type) do cytoplazmy Zygoty wykazywały prawidłową implantację w macicy matki zastępczej. Rozwój płodowy przebiegał prawidłowo, w etapach późniejszych także nie zauważono żadnych nieprawidłowości rozwojowych.

Anti-CD9 mAb (immunoblot) Rys10. Wpływ przeciwciał anty-CD9 (mAb) na proces zapłodnienia in vitro (oocyty z osłonką przejrzystą) Anti-CD9 mAb (immunoblot) hamuje proces zapłodnienia in vitro w oocytach CD9+/+ nie blokuje wiązania plemnika do powierzchni błony oocytu (duża ilość plemników w przestrzeni prewitalnej) IVF - in vitro fertilization mAb - monoclonal antibody Przeciwciało skierowane przeciw podjednostce alfa-6 integryny hamuje wiązanie plemnika do powierzchni oocytu, można przypuszczać, że integryna bierze udział w wiązaniu plemnika, zaś CD9 w fuzji z plemnikiem

CD9 wpływa na fuzję z plemnikiem, lecz nie na proces jego wiązania Rys10. Wpływ przeciwciał anty-CD9 (mAb) na proces zapłodnienia in vitro (oocyty z osłonką przejrzystą) Anti-CD9 mAb (immunoblot) hamuje proces zapłodnienia in vitro w oocytach CD9+/+ nie blokuje wiązania plemnika do powierzchni błony oocytu (duża ilość plemników w przestrzeni prewitalnej) CD9 wpływa na fuzję z plemnikiem, lecz nie na proces jego wiązania

integryna α6β1 jest receptorem dla plemnika (wiązanie się z fertyliną) Rys. Model roli białka CD9 w oddziaływaniach pomiędzy fertiliną i integryną α6β1 ( wg Chena i wsp. 1999). integryna α6β1 jest receptorem dla plemnika (wiązanie się z fertyliną) przekazanie sygnału od integryny α6β1 na CD9 inicjacja i aktywacja fuzji gamet

Podsumowanie inicjacja i aktywacja fuzji gamet CD9 ma zasadnicze znaczenie w procesie zapłodnienia CD9 wpływa na fuzję z plemnikiem, lecz nie na proces jego wiązania integryna α6β1 jest receptorem dla plemnika (wiązanie się z fertyliną) przekazanie sygnału od integryny α6β1 na CD9 inicjacja i aktywacja fuzji gamet

THE END