Czułość pomiarów NMR

Intensywność ~ [stężenie] (Int ~ c) Efekt akumulacji: S/N ~ nt1/2 nt – liczba zsumowanych sygnałów FID Moment magnetyczny jądra i pole B0: Int ~ (5/2)B0(3/2) Efekt NOE: Int(max) = (1 + S/2I) Int0 Przeniesienie polaryzacji S I: Intmax = S/I Niektóre czynniki wpływające na jakość rejestrowanego widma

Schemat sekwencji INEPT ogniskowany Wąskie prostokąty reprezentują impulsy 90º a szerokie – impulsy 180º. Inne oznaczenia: td – przerwa relaksacyjna, w której układ dochodzi do stanu równowagi termodynamicznej z otoczeniem, d2 = 1/(4J), d3 = (0,15 - 0,25)/J, at – czas rejestracji FID 90 180 t d 2 3 o s p r z . I S A B C D E at Schemat sekwencji INEPT ogniskowany (INEPT = Insensitive Nuclei Enhanced by Polarization Transfer)

CH CH2 CH3 Postać multipletów spinu I w grupach IS, IS2 i IS3, rejestrowanych za pomocą sekwencji INEPT z kompensacją równowagowej intensywności spinu I.

Układ spinowy a = 45º a = 90º a = 135º IS 0,71(gS/gI) (gS/gI) IS2 –(gS/gI) IS3 1,06(gS/gI) Wzmocnienie sygnału spinów I spowodowane przeniesieniem polaryzacji od spinów S w technice DEPT

Standardowe widmo 13C NMR i widmo DEPT(135) próbki sacharozy zanieczyszczonej metanolem, zarejestrowane z odsprzęganiem od protonów

≡C-H 3’ 2’ 1 2 4 3 1’ 1” ppm Sygnał główny i sygnały satelitarne acetylenowego protonu 1-bromoetynylo-4-etynylobenzenu

Niektóre zaawansowane techniki pomiarowe

Koncepcja spektroskopii wielowymiarowej Sekwencja pomiarowa służąca do rejestracji standardowego widma 1D NMR: (td) – (impuls ) – (at) Sekwencja pomiarowa służąca do rejestracji widma 2D NMR: (td) – (t1) – (tm) – (at) Sekwencja pomiarowa służąca do rejestracji widma 3D NMR: (td) – (t1) – (tm) – (t3) – (tm2) – (at) Koncepcja spektroskopii wielowymiarowej

Koncepcja spektroskopii wielowymiarowej Poglądowe przedstawienie dwuwymiarowej spektroskopii NMR Koncepcja spektroskopii wielowymiarowej

Koncepcja spektroskopii wielowymiarowej Etapy sekwencji pomiaru widma dwuwymiarowego: przygotowanie, td - wytwarzany jest nierównowagowy stan układu spinowego inkrementowany czas ewolucji, t1 - znakowanie koherencji spinowych częstościami 1 mieszanie, tm - przeniesienie koherencji pomiędzy oddziałującymi spinami detekcja, t2 - rejestracja sygnału FID, zawierającego informacje bezpośrednio o częstościach 2 i pośrednio o częstościach 1

Dwuwymiarowa technika COSY 90x 90x Sekwencja COSY służąca do korelowania przesunięć chemicznych spinów oddziałujących skalarnie Dwuwymiarowa technika COSY

Dwuwymiarowa technika COSY Schematycznie przedstawione widmo 2D typu COSY, w którym korelacja spinów jest wywoływana sprzężeniem skalarnym. Sygnały diagonalne (D) odpowiadają widmu 1D podczas gdy sygnały niediagonalne wskazują na obecność sprzężenia skalarnego pomiędzy spinami.

WIDMO PROTONOWE KROTONIANU ETYLU H H H H H 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 1.0 1.0 2.0 3.0 3.0

WIDMO COSY KROTONIANU ETYLU

Widmo 1D 1H NMR roztworu sacharozy w D2O z dodatkiem metanolu .  Widmo 1D 1H NMR roztworu sacharozy w D2O z dodatkiem metanolu

Widma COSY z filtrem dwukwantowym - DQF-COSY. 1 2 2 3 3 1  Widmo 2D 1H-1H DQF-COSY roztworu sacharozy w D2O z dodatkiem metanolu

Widmo 1D 1H NMR roztworu sacharozy w D2O z dodatkiem metanolu . 1 2 3 2 1 3  Widmo 1D 1H NMR roztworu sacharozy w D2O z dodatkiem metanolu

Widmo 1D 1H NMR teakryny w CDCl3

Widmo 1D 13C NMR teakryny w CDCl3 2 3 6 5 4 7 8 9 CDCl3

Detekcja odwrotna. Widmo 2D 1H-13C HMBC teakryny. 6 5 4 7 8 9 H7 H9 H3 C6 C8 C2 C4 C5

Widmo 1D 1H NMR teakryny w CDCl3 2 3 6 5 4 7 8 9 3 9 7 1 Widmo 1D 1H NMR teakryny w CDCl3

Widmo 1D 13C NMR teakryny w CDCl3 2 3 6 5 4 7 8 9 6 8 2 4 5 Widmo 1D 13C NMR teakryny w CDCl3

Detekcja odwrotna. Widmo 2D 1H-13C HSQC teakryny

Widmo 1D 13C NMR teakryny w CDCl3 9 7 1 1 2 3 6 5 4 7 8 9 6 8 2 4 5 Widmo 1D 13C NMR teakryny w CDCl3

Impulsowe gradienty pola magnetycznego Częstość precesji spinów w polu magnetycznym B0 z nałożonym liniowym gradientem: |L(z)| = (B0 + gz z) Dwa impulsy gradientowe o przeciwnej polaryzacji stanowiące najprostszą sekwencję ogniskującą Sekwencja gradientowego echa spinowego

Technika Informacja Inversion-recovery Spinowe echo CPMG INEPT DEPT Pomiar T1 Spinowe echo Wygaszanie szerokich linii i zakłóceń, element innych sekwencji, pomiary dyfuzji CPMG pomiar T2 INEPT Przenoszenie polaryzacji S I, rejestracja I kontrolowana przez T1(S) DEPT Przenoszenie polaryzacji S I, rozróżnianie IS, IS2 i IS3, „edycja”, rejestracja I kontrolowana przez T1(S), edycja widm Najważniejsze techniki jednowymiarowej spektroskopii NMR 1D

Najważniejsze techniki dwuwymiarowej spektroskopii NMR Technika Informacja Korelacje poprzez homojądrowe Jij; współrzędne δ(Hi), δ(Hj) Cosy (Correlation spectroscopy) sprzężenia par jąder DQCOSY (Double-Quantum Correlation COSY ) lepiej czytelne COSY, brak sygnałów singletowych na diagonali TOCSY (total correlation spectroscopy) wszystkie sprzężenia w obrębie całego układu spinowego Korelacje poprzez heterojądrowe Jij; współrzędne δ(Xi), δ(Hj) (detekcja odwrotna) HSQC (heteronuclear single quantum correlation) sprzężenia przez jedno wiązanie HMBC (heteronuclear multi bondcorrelation) sprzężenia przez więcej niż jedno wiązanie HMQC (heteronuclear multi quantum correlation) sprzężenia przez jedno lub więcej wiązań (mniej selektywne) Korelacje poprzez oddziaływania dipolowe (NOE); współrzędne δ(Hi), δ(Hj) NOESY (NOE spectroscopy) odległość pomiędzy Hi i Hj; zanika jeśli ω0 c~1 ROESY (rotating frame NOE SY) odległości międzyjądrowe; działa również dla ω0 c=1 Korelacje przez wymianę chemiczną; współrzędne δ(Xi), δ(Xj) EXSY (exchange SY) schemat i szybkość wymiany chemicznej

Widmo 1H NMR moczu - kwasica argininobursztynowa. Asa - kwas argininobursztynowy Ala – alanina Cr – kreatyna Crn - kreatynina, Dma – dimetyloamina Gly - glicyna Widmo 1H NMR moczu - kwasica argininobursztynowa.

Widmo 13C NMR moczu pacjenta chorego na alkaptonurię