Przechowywanie szczepów w warunkach domowych www.warzymypiwo.pl

Zawartość szkolenia Trochę teorii o drożdżach Potrzebne akcesoria- przechowywanie drożdży w laboratorium i w domu Co to jest agar? Co to jest żelatyna? Procedura przygotowania podłoża Procedura posiewu Namnażanie szczepu do warki Zakażenia Gdzie kupić sprzęt?

Używane pojęcia Szczep Kolonia Eza Bakterie Drożdzaki Eukarionty Prokarionty Szafa laminarna Pasaż Posiew pH Żelatyna Agar Białka Cukry Tłuszcze Mitoza Mejoza Posiew redukcyjny Inkubacja Prośba! W przypadku wszelkich niejasności pytajcie!!!

Świat ożywiony

Drożdże (Saccharomyces sp.) Fermentacja spontaniczna (Belgijski Lambic) Lactobacillus sp. Pseudomonas sp. Candida sp. Klockera sp. Hansenula sp. Pichia sp. Fermentacja górna (Brytyjskie Ale) Saccharomyces cerevisiae Fermentacja dolna (Pilsner, Lager) Saccharomyces pastorianus

Drożdże- morfologia

Drożdże- cykl komórkowy Mitoza: 71 minut G1 + S + G2: 54 minuty Cykl komórkowy: 125 minut Schemat cyklu komórkowego. M- mitoza (podział), G1, G2, S- interfaza, Go- faza spoczynku

Drożdże browarnicze- formy przechowywania Drożdże płynne (Wyeast Labs) Drożdze suche (Fermentis) Szczepy na skosach (kolekcja szczepów)

Co potrzebujemy do utrzymania kolekcji szczepów w laboratorium? Lodówka (koniecznie powyżej zera!), 5-15oC Probówki (najlepiej zakręcane) Podłoże (oparte na agarze) Ezy 10 ul (platynowy drucik lub lepiej plastikowe sterylne) Szafa laminarna Palnik do opalania ezy i probówek Alkohol etylowy 70%

Co to jest agar? Agar- substancja żelująca, której głównym składnikiem są polimery cukru galaktozy: agaroza i agaropektyna. Agar-agar dobrze rozpuszcza się w wodzie o temperaturze ok. 85-90 °C, a zestala się, tworząc rodzaj żelu w 32-40 °C. Zestalony żel rozpuszcza się po ponownym podgrzaniu do 85-90 °C (histereza agaru). Agar wytwarzany jest z krasnorostów (Rhodophyta), wydobywanych głównie u wybrzeży Japonii, głównie z rodzaju Gelidium. Jest mieszaniną silnie żelującej agarozy (70%) i dającej lepkie roztwory agaropektyny (30%). Agar poligalaktozydem, w którym 90% galaktozy występuje w formie D (naturalna), a 10% w formie L (nie trawiona) Na czym polega fenomen agaru? Agaroza i agaropektyna to policukry, które nie są trawione przez praktycznie żadne organizmy na ziemi Stężenie agaru w pożywkach to 10-15 g/l

Podłoża bakteryjne i grzybowe Podłoże grzybowe Sabouraud Typowy skład (g/litr): pepton z kazeiny 5,0, pepton mięsny 5,0, D-glukoza 40,0, agar 15,0 Przygotowanie: Rozpuścić 65 g/litr, autoklawować 15 min 121oC), nie przegrzać, pH 5,6+/- 0,2 w 25oC Podłoże bakteryjne TSA Typowy skład (g/litr): pepton z kazeiny 15,0; pepton z soi 5,0; chlorek sodu 5,0; agar 15,0 Przygotowanie: Rozpuścić 40 g/litr, autoklawować 15 min, 121 °C, pH: 7,3 ± 0,2 w 25 °C Podłoże grzybowe ekstrakt słodowy z agarem Typowy skład (g/litr): Ekstrakt słodowy 100,0, agar 15,0, Przygotowanie: Rozpuścić 115 g/litr, autoklawować 15 min 121oC, nie przegrzać, pH 6,0-6,2 +/- 0,2 w 25oC Wniosek: bakterie rosną w pH zasadowym, a drożdże w kwaśnym

Co to jest pH? Skala pH – ilościowa skala kwasowości i zasadowości roztworów wodnych związków chemicznych. Skala ta jest oparta na aktywności jonów hydroniowych [H3O+] w roztworach wodnych. Tradycyjnie pH definiuje się jako: pH = -log10[H3O+] czyli ujemny logarytm dziesiętny aktywności jonów hydroniowych wyrażonych w molach na decymetr sześcienny. Aby zrozumieć sens tej skali trzeba się najpierw przyjrzeć temu, co dzieje się w chemicznie czystej wodzie. Cząsteczki wody (H2O) ulegają samorzutnej autodysocjacji, co prowadzi do powstawania jonów H3O+ i OH- 2H2O ⇌ H3O+ + OH- Reakcja ta jest odwracalna i ma równowagę przesuniętą silnie w lewo, czyli w stronę wody niezdysocjowanej. Stężenie jonów H3O+ w czystej wodzie w temp. 25°C wynosi 10-7 mol/l, a jej pH = -log(10-7) = 7. Ponieważ w czystej wodzie stężenie jonów wodorowych i wodorotlenowych jest takie samo, woda (czysta) ma odczyn obojętny (pH wynosi 7). W roztworach o pH < 7 stężenie jonów wodorowych jest większe niż wodorotlenowych i roztwory takie mają odczyn kwasowy, natomiast w roztworach o pH > 7 większe jest stężenie jonów wodorotlenowych, więc roztwory takie mają odczyn zasadowy.

Co potrzebujemy do utrzymania kolekcji szczepów w domu? Słoiczki zakręcane (wąskie, najlepiej po oliwkach) Podłoże (oparte na agarze lub żelatynie) Ezy (drucik miedziany lub z żelaza- rozprostowany spinacz) Palnik z kuchenki gazowej do opalania brzegów probówek (opcja) Alkohol etylowy 96% Lodówka (koniecznie powyżej zera!), 5-15oC

Podłoża do przechowywania grzybów- oparte na żelatynie Żelatyna (gelatin) – naturalna substancja białkowa pozyskiwana z kości i chrząstek zwierzęcych (kolagen). 98-99% suchej masy żelatyny to białka. Zawiera bardzo dużą ilość aminokwasów cyklicznych proliny i hydroksyproliny. Rozpuszczona w wodzie tworzy układ koloidalny – zol liofilowy, który łatwo przechodzi w żel, o ile temperatura otoczenia nie jest zbyt wysoka. Topi się w 35oC, zestala się w 25oC, pH 5,5-5,7 Stężenie żelatyny w pożywkach to 30-50 g/l Podłoże grzybowe ekstrakt słodowy z żelatyną Typowy skład (g/litr): Ekstrakt słodowy 100,0, żelatyna 30,0, Przygotowanie: Rozpuścić 130 g/litr, autoklawować 15 min 121oC, nie przegrzać, pH 5,6+/- 0,2 w 25oC

Porównanie agaru i żelatyny Parametr Agar Żelatyna Temperatura topnienia 85-90 °C 35 °C Temperatura zestalenia się 32-40 °C 25 °C Hydrolizowane przez drożdże Nie Hydrolizowane przez bakterie Generalnie Tak Plusy Odporny na hydrolizę bakteryjną Duża dostępność, niska cena Minusy Mała dostępność Hydrolizowana przez niektóre bakterie

Procedura przygotowania podłoża- 100 ml Odważ 3 g żelatyny lub 1,5 g agaru, wrzuć do garnka lub słoika Odważ 10 g ekstarktu słodowego, wrzuć do garnka Zalej 100 ml wody (może być gotująca) Zagotuj podłoże w garnku i delikatnie gotuj dalej aż do rozpuszczenia agaru/ żelatyny lub też włóż słoik do łaźni wodnej i gotuj aż do rozpuszczenia agaru/ żelatyny Wlej do probówek/ słoiczków do 1/3 wysokości Nałóż zakrętki, ale nie zakręcaj!!! Zakręcenie spowoduje eksplozję! Umieść probówki/ słoiczki w łaźni wodnej i gotuj przez 15 minut Ułóż na pochylni i zaczekaj do zastygnięcia Opcja- można pozostawić na 24 h i zagotować ponownie Dokręć zakrętki (dopiero po wystygnięciu do temperatury otoczenia) Uwaga! Podłoże jest gotowe do zaszczepienia po 24h (musi być ustabilizowane) Uwaga! Podłoże nie może być przechowywanie na słońcu ze względu na przyspieszone procesy starzenia i powstawanie wolnych rodników Podłoża ogólnonamnażające (o takich tu mówimy) nadają się do zaszczepienia przez około 3 miesiące

Jakość podłoży mikrobiologicznych Sterylność- należy przetrzymać gotowe skosy przez 3-5 dni w temperaturze pokojowej. Jeżeli nie widać zmian n podłożu ani żadnego wzrostu to podłoże jest sterylne Żyzność- parametr opisujący zdolność podłoża do podtrzymywania wzrostu. Dla podłoży wybiórczych może mieć wartość nawet 30% (na 100 posianych komórek wyrasta 30) Stabilność- spadek żyzności wraz z czasem przechowywania. Spadek do 70% uważany jest za nieszkodliwy. Poniżej 70% wartości wyjściowej podłoże nie nadaje się do posiewu szczepów. Dla podłoży ogólnonamnażających spadek 70% następuje po około 5-6 miesiącach składowania szczepu

Ożywianie szczepów Uwaga! Przed odkręceniem zakretki probówka/ słoik musi być wyciągnięta z lodówki i doprowadzona do temperatury otoczenia! Jest to 15-20 minut w 20-25oC W przeciwnym wypadku (zimna probówka) na wewnętrznych ściankach probówki skropli się woda i osiądą cząsteczki zawieszone w powietrzu wraz z bakteriami Pewne zakażenie szczepu!

Technika pracy przy posiewie- laboratorium

Technika pracy przy posiewie- warunki domowe Sterylizacja ezy 96% spirytusem Zamoczyć ezę w spirytusie na kilka- kilkanaście sekund Wytrzeć ezę w ręcznik papierowy nasączony spirytusem Poczekać kilka sekund do ulotnienia się spirytusu Przesiać szczep (pobrać ezą z jednej probówki i przenieść do drugiej) Umieścić probówki na dwa dni w temperaturze pokojowej 20-25 °C Uwaga! Po jednym dniu inkubacji na chwilę odkręcić zakrętkę (poluzować do usłyszenia syknięcia) i natychmiast zakręcić ponownie Po dwóch dniach umieścić w lodówce w temperaturze 5-15 °C Przechowywać do pół roku

Idealny model kolekcji szczepów Skosy macierzyste Skosy robocze Namnażanie do warki Każdy skos maksymalnie 5 otwarć/ 5 pasaży (!) Przechowywanie na skosie do pół roku (!)

Namnożenie szczepu do warki Należy stosować zasadę rozcieńczenia 1:10. Browary zaczynają od 5 ml. My spokojnie możemy zacząć od 50 ml i dojść do 500 ml (dwa etapy, a nie trzy). Namnażanie w warunkach maksymalnego dostępu tlenu, temperatura 20-25oC dla drożdży górnej i dolnej fermentacji! Szczepy górnej fermentacji na 20l warkę- starter 1 l Szczepy dolnej fermentacji na 20l warkę- starter 2 l Uwaga! Po namnożeniu drożdży i ich opadnięciu na dno wylać zużytą pożywkę i użyć samych drożdży z dna!!! Dobra fermentacja powinna zastartować po 10h od dodania drożdży! Słoik 100 ml, ale starter 50 ml. Trzeba zostawić miejsce na powietrze! Inkubować 2 dni. Wytrzasnąć 1x dziennie (natlenianie) Słoik 1000 ml, ale starter 500 ml. Trzeba zostawić miejsce na powietrze! Inkubować 3-4 dni. Wytrzasnąć 1x dziennie (natlenianie)

Zapobieganie zakażeniom kolekcji drożdży Stosowanie pełnego modelu kolekcji szczepów (skosy macierzyste i robocze) Stosowanie rękawiczek lateksowych Stosowanie palnika do opalania brzegów probówki Przestrzeganie zasady pięciu otwarć/ pięciu pasaży Stosowanie właściwych podłoży (kwaśne pH) Stosowanie zakręcanych probówek (ograniczenie dostępu tlenu) Stosowanie dedykowanych ez do danego szczepu

Co robić w sytuacji zakażenia? Posiew redukcyjny do uzyskania pojedynczych kolonii. Czystą kolonię przesiać na szczep. Uwaga! Nie pomylić bakterii z drożdżami! Kolonie drożdży rosną wolniej (2-3 dni), są duże i kremowo-białe.

Gdzie to można kupić? Browamator Agar-agar 10g Substancja żelująca, surowiec niezbędny do przygotowania pożywki wykorzystywanej do przechowywania szczepów drożdży (skosy agarowe). Przygotowanie pożywki: rozpuścić 2 g agaru-agaru w 100 ml gorącej (ok. 95*C) niechmielonej brzeczki piwnej o ekstrakcie ok. 10*Blg. Następnie odmierzoną ilość pożywki rozlać do próbówek i przeprowadzić sterylizację. Opakowanie zawiera: 10 g agaru-agaru w formie proszku. Wysyłka do 7 dni 7 zł. 30 gr. Szklana próbówka z zakrętką 160 x 16 mm Szklana próbówka z zakrętką, polecana do przechowywania i transportu drożdży. Wykonana z wysokiej jakości materiałów, może być sterylizowana w temp. do 120°C. Wymiary: - wysokość: 160 mm, - średnica: 16 mm. Wysyłka do do 7 dni 3 zł. 60 gr. Muntons Spraymalt - Extra Light (Extra Jasny) - 500 g Ekstrakt słodowy w proszku - wersja Extra Light - Extra Jasny. Oryginalny produkt Muntons PLC (Anglia). Zastosowanie: składnik brzeczki piwnej, polecany do jasnych piw w stylu amerykańskim oraz do jasnych lagerów (przy 20 litrach piwa uzyskanie 1°Blg wymaga użycia ok. 0, 25 kg ekstraktu w proszku), - surowiec do przygotowania startera drożdżowego (100 g na 1 litr startera), - surowiec do refermentacji (przeciętnie 200 g na 20 litrów piwa). Opakowanie zawiera 500 g ekstraktu słodowego w proszku. Kolor: max 8 EBC. Wilgotność: max 5%. Białko: max 7, 5%. pH: 5, 6. Wysyłka do do 7 dni 14 zł. 90 gr.